¿Es funcional la biorremediación en la eliminación de níquel en un suelo contaminado?
¿Es funcional la biorremediación en la eliminación de níquel en un suelo contaminado?
Jesica Araceli Alonso-Arena1, Adriana Carbajal-Armenta1, Dolores Castañeda-Antonio2*iD, Yolanda Elizabeth Morales-García iD2, María del Rocío Bustillos-Cristales iD2, Paulina Itzel Morales-Sandoval3, Juana Deysi Santamaría-Juárez4, Ricardo Munguía-Pérez2.*
1Facultad de Ciencias Biológicas, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP). Edificio Multilaboratorios 6, Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla, México. C.P. 72570. 2ICUAP (Instituto de Ciencias Universidad Autónoma de Puebla)-Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana. Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla, México. C.P. 72570. 3Jardín Botánico Universitario, BUAP. Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla, México. C.P. 72570. 4Facultad de Ingeniería Química, Laboratorio de análisis Instrumental, 18 sur y Av. San Claudio, Puebla, México, C.P. 72590. *lolisjessy@yahoo.com.mx
http://doi.org/10.5281/zenodo.5091147
Bajar cita (RIS): Alonso-Arena y cols., 2019 AyTBUAP 4(14): 30-48
Editado por: Jesús Muñoz-Rojas (Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla)
Fecha de Publicación: 26 de junio de 2019
EOI: https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.04.14.03
URI: https://hdl.handle.net/20.500.12371/9327
Referencia: Alonso-Arena JA, Carbajal-Armenta A, Castañeda-Antonio D, Morales-García YE, Bustillos-Cristales M del R, Morales-Sandoval PI, et al. ¿Es funcional la biorremediación en la eliminación de níquel en un suelo contaminado? Alianzas y Tendencias BUAP [Internet]. 2019;4(14):30–48. Available from: https://www.aytbuap.mx/publicaciones#h.mt3wsgncfypj
RESUMEN
La contaminación por metales pesados representa un problema creciente en la cultura industrializada. Representan una amenaza biológica, pues no son biodegradables, aunque existen mecanismos que poseen los organismos para acumular, traslocar, transformar, inmovilizar o estabilizarlos. El níquel es un metal pesado presente en descargas mineras, en la industria de la fundición, refinación de elementos metálicos, entre otras. Es conocido que la asociación de plantas con algunas bacterias benéficas ayuda a las plantas a tolerar niveles de estrés como la contaminación por metales pesados. En el presente trabajo se propuso remediar suelo contaminado con níquel, con ayuda de Medicago sativa, una planta hiperacumuladora, en asociación con la cepa promotora de crecimiento y biorremediadora Pseudomonas putida KT2440. Se establecieron tratamientos semi-hidropónicos donde se trasplantaron germinados de M. sativa inoculados y no con la cepa bacteriana. Se determinó la concentración del metal en el suelo a distintos tiempos de tratamiento por medio de espectrofotometría de absorción atómica. La cepa bacteriana, 15 días posteriores al montaje del experimento, no fue posible detectarla, tampoco se observó tolerancia al estrés por la planta. Sin embargo, hubo un establecimiento prolífico de hongos y los ensayos de absorción atómica revelan una disminución significativa en los niveles de concentración de níquel en el suelo.
Palabras clave: Contaminación de suelo; Medicago sativa; Metales pesados; Microorganismos mesófilos; Plantas hiperacumuladoras; Pseudomonas putida KT2440.
ABSTRACT
Heavy metal pollution represents a growing problem in the industrialized culture. They represent a biological threat, because they are not biodegradable, although there are mechanisms that the organisms possess to accumulate, translocate, transform, immobilize or stabilize them. Nickel is a heavy metal present in mining discharges, in the foundry industry, refining of metallic elements, among others. It is known that the association of plants with some benefidal bacteria helps plants to tolérate stress levels such as heavy metal contamination. In the present work it was proposed to remedy soil contaminated with nickel, with the help of Medicago sativa, a hyperaccumulating plant, in association with the growth promoter and bioremediator strain P. putida KT2440. Semi- hydroponic treatments were established where germinated M. sativa inoculated were transplanted and not with the bacterial strain. The concentration of the metal in the soil at different treatment times was determined by means of atomic absorption spectrophotometry. The bacterial strain, 15 days after the assembly of the experiment, it was not possible to detect it, ñor was tolerance to stress by the plant observed. However, there was a prolific establishment of fungí and the atomic absorption reveal a significant decrease in the concentration levels of nickel in the soil.
Keywords: Heavy metals; Hyperaccumulative plants; Medicago sativa; Mesophilic microorganisms; Pseudomonas putida KT2440; contaminated soil.
INTRODUCCIÓN
La contaminación por metales pesados es un problema que ha ¡do en aumento en los últimos años debido al incremento en las actividades antropogénicas tales como la minería, la metalurgia, la agricultura o el aumento en el número de vehículos que transitan por México [1]. Esta contaminación es debida a dispersión de sólidos, líquidos o partículas finas liberadas a la atmósfera que entonces se depositan en cuerpos de agua, sedimentos y suelos [2].
Entre los contaminantes, el níquel es uno de los metales pesados presentes en descargas mineras, en la industria de la fundición, refinación de elementos metálicos, entre otras industrias que utilizan este metal como materia prima. Su presencia en lodos residuales utilizados como fertilizantes es una de las causas de la contaminación en suelos y plantas [2].
Está reportado, desde 1988, que el níquel es un elemento esencial para las plantas [3] pero de igual forma es fitotóxico cuando está presente en altas concentraciones [4] al igual que disminuye la biodisponibilidad de otros nutrientes necesarios para la absorción y translocación a los diferentes órganos de las plantas provocando deficiencias serias en su crecimiento y desarrollo [5].
Algunas plantas son capaces de acumular grandes cantidades de metales pesados, y se les conoces como "hiperacumuladoras" [6]. Estas generalmente tienen poca biomasa debido a que utilizan más energía en los mecanismos que son necesarios para adaptarse a las altas concentraciones de metal en sus tejidos [7]. Esta capacidad varía dependiendo de la especie vegetal y su metabolismo, el metal pesado, el suelo de cultivo y la interacción planta-raíz-metal [8].
Asimismo, los microorganismos son vitales en la transformación de compuestos ya que influencian su biodisponibilidad y remediación, pueden alterar la toxicidad, solubilidad en agua y la movilidad del elemento [9]. Los microorganismos modifican la concentración de metales pesados en el ambiente, ya que cuentan con mecanismos enzimáticos y no enzimáticos para remover metales en suspensión [10]. Entre las transformaciones enzimáticas de los metales realizadas por microorganismos se encuentran la oxidación, reducción, metilación y desmetilación, las cuales como resultado pueden dar compuestos poco solubles en agua o compuestos volátiles [11].
En base a lo anterior y en un esfuerzo por comprender mejor las bases fisiológicas de la toxicidad del níquel en los diferentes ensayos, el objetivo de este trabajo fue: evaluar el efecto del níquel a 3000 ppm sobre la especie Medicago sativa L., la capacidad de P. putida KT2440 de crecer en suelo contaminado con níquel y la simbiosis entre la planta y la bacteria para la eliminación del metal pesado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo de suelo.
El procedimiento de muestreo se llevó a cabo de la siguiente manera: Se seleccionaron 3 puntos de muestreo de forma aleatoria (Figura 1) dentro de Ciudad Universitaria de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP).
• En cada uno de los tres puntos, se tomó, con ayuda de una espátula y un bieldo pequeños, aproximadamente 1 kg de suelo y se depositó en una tina de plástico limpia. En total se obtuvo un peso de muestra compuesta de aproximadamente 3 kg de suelo.
• Posteriormente, se tamizó la muestra de suelo con ayuda de coladores de plástico. Una vez tamizada la muestra compuesta, se colocó en bolsas de plástico y se transportó al laboratorio.
Determinación de pH
La medición de pH del suelo se llevó a cabo siguiendo algunos de los lincamientos de la NOM- 021-RECNAT-2000 que establece las especificaciones de fertilidad, salinidad y clasificación de suelos.
Se determinó el pH con un potenciómetro portátil (USA, ATC). Se obtuvo una muestra compuesta total de lg de suelo de cada uno de los tratamientos (Suelo sin contaminar, suelo con níquel, suelo con níquel + M. sativa, suelo con níquel + P. putida KT2440, suelo con níquel + M. sativa + P. putida KT2440). Por separado cada gramo de muestra compuesta se colocó en un recipiente plástico y se añadieron 10 mL de agua destilada. Se mantuvieron en agitación constante a intervalos de 5 minutos durante media hora. Se dejó reposar 15 minutos y se procedió a tomar la medida con el potenciómetro.
Figura 1. Croquis de la zona de muestreo en Ciudad Universitaria BUAP.
Determinación de materia orgánica del suelo
La determinación de la materia orgánica del suelo muestreado se evaluó de acuerdo con la NOM-021- RECNAT-2000, que establece las especificaciones de fertilidad, salinidad y clasificación de suelos, estudios, análisis y muestreo.
La NOM propone el método Walkley y Black, este método detecta entre un 70-80% del carbono orgánico total, más un factor de corrección variable para cada tipo de suelo. En México, dicho factor es de 1.298.
Tabla 1. Clasificación del suelo de acuerdo con su pH extraído de NOM 021 RECNAT 2000
Primeramente, se pesaron 0.25 g de suelo seco y se colocaron en un matraz de 500 mL, se procesó un blanco a la par. Se adicionaron 5 mL de K2Cr2O7 y se mezcló con el objetivo de que entrase en contacto con toda la muestra de suelo. Se agregaron 10 mL de H2SO4 por las paredes. Se agitó por 1 minuto y posteriormente se dejó reposar 30 min. Una vez pasado el tiempo de reposos, se añadieron 10 mL de agua destilada, se agregaron 2.5 mL de H3PO4 concentrado, y 5 gotas de indicador difenilamina. Por último, se procedió a titular con FeSO4 gota a gota con ayuda de una bureta hasta observar el viraje a color esmeralda.
De acuerdo con la NOM-021-RECNAT-2000,
%C orgánico = ((B-T)/g)(N)(0.39) mcf
donde:
B= Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar el blanco de reactivos (mL)
T= Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar la muestra (mL)
N=Normalidad exacta del sulfato ferroso g=Peso de la muestra empleada mcf= 1/0.77= 1.298
mfc es el factor de corrección de humedad, ya que como con este procedimiento se detecta entre un 70-84% del carbono orgánico total, es necesario introducir este factor de corrección, el cual puede variar entre suelo y suelo de acuerdo con la condición geográfica. Finalmente se compara con la tabla 2 para establecer la clasificación de materia orgánica.
Tabla 2. Valores de referencia para clasificar la concentración de la materia orgánica en los suelos minerales y volcánicos
Germinación de semillas de alfalfa (Medicago sativa L.)
Con el objetivo de obtener germinados de la planta M. sativa y poder utilizarla como modelo de biorremediación de níquel en este experimento, se seleccionaron 66 semillas, cuyo primer filtro de selección fue dejarlas en agua para descartar aquellas que flotaran debido a algún daño físico de la semilla. Se llevó a cabo en condiciones de esterilidad bajo campana de flujo laminar, un proceso de desinfección con lavados con etanol al 70% y con NaCIO al 0.15% [12].
Una vez realizada la desinfección, se procedió a colocar, en una placa Petri, algodón estéril y se humedeció con agua en la misma condición. Se colocaron de 15 a 20 semillas de alfalfa en cada caja con ayuda de pinzas estériles, y se sellaron. Por último, se incubaron en oscuridad a 30°C durante 6 días [12].
Cuenta total de microorganismos mesófilos
Se tomó 1 gramo de muestra compuesta de cada uno de los tratamientos. Se homogenizó en 9 mL de agua destilada estéril y se procedió a realizar diluciones 1:10 de las mismas. Anteriormente, se había preparado medio sólido para "Método estándar" que se dejó enfriar sin gelificar. En cajas Petri estériles se inoculó 1 mL de las diluciones 10’3 y 10"4 de cada uno de los tratamientos. Posteriormente se agregó el medio que se encontraba a una temperatura templada y se homogenizó con el inoculo (6 giros en sentido de las manecillas del reloj y 6 giros en sentido contrario a las manecillas del reloj), y se dejó gelificar el medio. Todo esto bajo condiciones de esterilidad en campana de flujo laminar. Por último, se incubaron por 72 horas a 30°C, con monitoreo cada 24 h [15].
Análisis de la concentración de níquel por espectrofotometría de absorción atómica
De acuerdo con la NOM-147-SEMARNAT/SSAI-2004 que establece los criterios para determinar las concentraciones de metales en suelos contaminados con arsénico, bario, berilio, cadmio, cromo hexavalente, mercurio, níquel, plata, plomo, selenio, tallo y/o vanadio, se debe llevar a cabo una digestión ácida de la muestra para poder medir la concentración del metal de interés en un espectrofotómetro de absorción atómica (marca PerkinElmer AAnalyst 400). El procedimiento modificado se describe en la figura 2.
Cálculo para la concentración de Níquel
Ni = (X) (factor de dilución) (0.05)/0.001 donde
X = concentración en mL/L
Factor de dilución = 1
0.05 = volumen de aforo en L (50 mL) 0.001 = muestra digestada en Kg (1 g)
Diseño experimental
Preparación de la cepa
La cepa P. putida KT2440 fue sembrada en medio de cultivo sólido Luria Bertani con una concentración de 100 µg/mL de antibiótico Cloranfenicol. La cepa fue resembrada de forma masiva. Se incubó durante 24 horas a 30 °C.
A las 24 horas, se prosiguió a recoger el crecimiento en la placa mediante la adición de 5 mL de agua destilada estéril y un posterior raspado sobre la placa para recolectar todo el crecimiento de la cepa sobre la placa. Se transfirió el raspado de la placa a un tubo Falcon estéril de 50 mL y se aforó la solución bacteriana hasta 40 mL con agua destilada estéril [32].
Figura 2. Procedimiento para llevar a cabo la digestión ácida de las muestras de suelo. Elaboración propia con herramienta didáctica Biorender. Disponible en https://app.biorender.com/
Preparación de las Jarras de Leonard
Para montar el experimento, se eligió el sistema hidropónico conocido como Jarras de Leonard [13], con algunas modificaciones. Dado que el suelo resultó ser rico en materia orgánica, la parte inferior de la botella se utilizó para sistema de drenaje. Las Jarras de Leonard se prepararon con botellas PET de 1.5 L cortadas a la mitad. Se les colocó una cuenda de algodón como conexión entre la parte superior e inferior y se colocó una gasa de algodón en la boquilla para detener la cuenda. Se esterilizaron por 20 minutos en luz UV en condiciones de flujo laminar [14].
Contaminación de suelo
De acuerdo con la NOM-147-SEMARNAT/SSAI- 2004, que establece los criterios para determinar las concentraciones de remediación de suelos contaminados con arsénico, bario, berilio, cadmio, cromo hexavalente, mercurio, níquel, plata, plomo, selenio, tallo y/o vanadio, el límite máximo permisible de concentración de níquel en suelo para uso agrícola comercial es de 1600 mg/Kg, mientras que, para uso industrial, el límite máximo permisible es de 20000 mg/Kg.
Primeramente, el suelo muestreado y tamizado se esterilizó a 15 libras de presión y 121 °C por 15 minutos. Se preparó 1L de una solución de 3000 ppm de NiSO4 con agua destilada estéril en condiciones de esterilidad bajo campana de flujo laminar. Posteriormente se procedió a agregar 100 mL de la solución contaminante a 10 de las 13 jarras que contenían un volumen de 200 cm3 de suelo, de acuerdo con la tabla 3. Cabe aclarar que 3 jarras con 200 cm3 de suelo, no se les adicionó solución contaminante se usaron como control.
A cada una de las jarras de Leonard preparadas previamente, se les agregó un volumen de 200 cm3 de suelo. Se les agregó 100 mL de la solución de NiSO4 a 10 de las jarras y se dejó impregnar el suelo por dos días. Posteriormente, se trasplantaron 3 germinados de M. sativa, en cada de las botellas destinadas a tratamiento con planta como se indica en la tabla 3: (suelo + M. sativa, suelo + níquel + M. sativa, suelo + níquel + P. putida KT2440 + M. sativa). Con respecto a los tratamientos con la cepa KT2440, se añadieron 9 mL por jarra a los tratamientos de Suelo + P. putida KT2440, suelo + níquel + P. putida KT2440, suelo + níquel + P. putida KT2440 + M. sativa . En los tratamientos con planta en combinación con la cepa bacteriana, se trasplantó primero el germinado, y la cepa bacteriana se añadió posteriormente en los puntos donde se colocó el germinado [14].
Tabla 3. Número de réplicas por tratamiento
Montaje de los ensayos
El montaje de las jarras de Leonard y de los trece ensayos se puede observar en la figura 3.
Figura 3. Jarras de Leonard realizadas con botellas PET de 1 L.
RESULTADOS
Determinación de pH
Los resultados obtenidos en la medición de pH para cada muestra compuesta de cada tratamiento se resumen en la tabla 4, destacando que el suelo se acidifica en presencia de la solución de Níquel.
Tabla 4. Resultados de pH de las muestras de suelo de cada tratamiento.
Determinación de materia orgánica del suelo
Ejemplo de cálculo:
%C orgánico suelo= ((9ml-6.1)/0.25g)(lN)(0.39)(l/0.77)=5.872 %
Para obtener el % de materia orgánica, se multiplica el % C por el factor 1.724, que es el factor de relación de contenido de carbono en la materia orgánica
%materia orgánica = (%C orgánico)(1.724) %matería orgánica suelo = (5.8721%)(1.724) % materia orgánica suelo = 10,123%
De acuerdo con los resultados obtenidos, el suelo analizado contiene un 10.123% de materia orgánica, lo cual, de acuerdo con la NOM-021- RECNAT-2000, indican que es un suelo con muy alto contenido de materia orgánica.
Porcentaje de germinación de semillas de alfalfa (Medicago sativa L.) y supervivencia a condiciones de estrés por contaminación con níquel
De las 66 semillas puestas a germinar, únicamente germinaron 48 semillas (Figura 4), obteniéndose así un porcentaje de germinación de 72.72%.
Ningún germinado de alfalfa, una vez trasplantado a suelo contaminado, logró desarrollar hojas verdaderas ni sobrevivió como en el ensayo mostrado en la figura 5 y 6. Se observó supervivencia a los 7 días, pero no desarrollo ni crecimiento de la plántula.
Figura 4. Germinados de M. sativa a 3 días posteriores al montaje.
Figura 5. (5a) El tratamiento de suelo con níquel + Medicago sativa + P. putida KT2440 el primer día del montaje. (5b) Una semana después. (5c) A las cuatro semanas del montaje, los germinados no lograron sobrevivir.
Figura 6. (6a) Se observa el tratamiento de suelo con níquel + Medicago sativa el primer día del montaje. (6b) Una semana después, se comienza a ver la formación de una película de hongo. (6c) Se muestra que después de cuatro semanas del montaje los germinados no sobrevivieron
Cuenta total de microorganismos mesófilos
Se monitoreó el crecimiento de P. putida KT2440 en placas a las 24 horas sin observar crecimiento. A las 48 horas se observó ligero crecimiento en algunas de las placas. Finalmente, a las 72 horas, se observó fácilmente el crecimiento en las placas.
En la figura 7, se muestran las diluciones inoculadas del ensayo que únicamente contenía suelo con níquel. Se observaron únicamente morfologías filamentosas, circulares, blanquecinas, lo que sugiere la presencia de hongos. Estos no fueron identificados, sin embargo, en ambas diluciones se muestran morfologías similares.
Figura 7. (7a) Se observa la dilución 10-4 de la muestra de suelo sin contaminar. Únicamente se observan 4 UFC con morfología de hongo. (7b) La dilución 10-3 , igualmente sólo se observa morfología de hongos, 39 UFC.
El ensayo de suelo contaminado con níquel e inoculado con la cepa P. putida KT2440 (Figura 8), mostró presencia de crecimiento filamentoso, aunque no se logra apreciar crecimiento de morfologías de origen bacteriano, lo que sugiere que la cepa inoculada no se logró recuperar a los 15 días posteriores del tratamiento.
Figura 8. Muestra de suelo contaminado con níquel, inoculado con la cepa Pseudomonas putida KT2440. No se logró obtener un conteo viable, ya que no se observaron colonias bacterianas aisladamente, por lo que puede suponerse que la cepa no logró sobrevivir a los 15 días.
En el tratamiento donde se trasplantó M. sativa, se observó mayor diversidad de morfologías (Figura 9), entre las que se encuentran hongos en su mayoría filamentosos (colonias circulares, colores blancos y algunos con centro café), y en menor proporción colonias de aspecto levaduriforme (aspecto mucoide, de colores blanco y crema). También se pudieron observar colonias más pequeñas que aparentemente pueden ser de origen bacteriano.
Figura 9. Tratamiento de suelo contaminado con níquel más la planta Medicago sativa, se observan tanto colonias bacterianas como de hongos. (9a) Dilución 10-4 , con 11 UFC tanto bacterianas como de hongos. (9b) Dilución 10-3 , con una densidad mayor de UFC, tanto bacterianas como de hongos.
En el ensayo tratado con la planta y la cepa P. putida KT2440, se obtuvo crecimiento en su mayoría de hongos filamentosos, observando la presencia de una colonia de aspecto bacteriano, sin embargo, la morfología de la colonia no coincide con la cepa inoculada, por tal motivo no se realizó una resiembra en medio selectivo.
Figura 10. Tratamiento de suelo contaminado con níquel más el germinado de M. sativa e inoculado con la cepa P. putida KT2440. (10a) dilución 10-4 , y (10b) dilución 10-3 . No se logra observar presencia de colonias bacterianas de la cepa buscada, por lo que se asume que la cepa no fue capaz de sobrevivir tampoco en este tratamiento.
Tabla 5. Número de unidades formadoras de colonias por ensayo obtenidas por cuenta total, de las diluciones 10-3 y 10-4.
En la tabla 5, se muestran las UFC/mL de cada uno de los tratamientos.
Concentración de níquel por absorción atómica
Una vez que las muestras de cada ensayo al día 60 de montaje, ya habían sido sometidas al proceso de digestión ácida se prosiguió al análisis por medio espectrofotómetro de absorción atómica.
Una curva estándar de concentraciones específicas de níquel fue realizada (Tabla 6, Gráfico 1).
Tabla 6. Valores de absorbancia para la curva estándar de calibración.
Gráfico 1. Curva de calibración realizada con los datos de absorbancia mostrados en la tabla 6
En la tabla 7 se muestran los resultados obtenidos en la cuantificación de níquel al inicio y final del experimento (día 2 y día 60).
Tabla 7. Concentración en ppm de Ni en diferentes ensayos
Se llevaron a cabo los cálculos con cada uno de los ensayos para determinar la concentración de metal en las muestras.
Ejemplo de cálculo:
[N¡]=(2.312)(0.005)/0.001=115.599 mg/Kg
DISCUSIÓN
Determinación de Materia Orgánica
El suelo analizado contiene un 10.123% de materia orgánica, lo cual, de acuerdo con los datos proporcionados por la NOM-021-RECNAT-2000, indican que es un suelo con muy alto contenido de materia orgánica. Lo cual lo hace un excelente sustrato para el desarrollo de las plantas M. sativa utilizada en este experimento. La alta presencia de materia orgánica puede deberse a que el lugar de muestreo fue una zona en la que se encontraban plantas ornamentales, además de encontrarse anexo a una obra en construcción, lo cual pudo haber contribuido a la presencia de materiales finos, principalmente arcillas silicatadas, como vermiculita y montmorillonita, que afecten el nivel de oxidación del carbono debido a la formación de microagregados estables que protegen la materia orgánica.
Sin embargo, estos tipos de determinación de la materia orgánica están sujetos a interferencias provocadas por algunos constituyentes del suelo siempre y cuando se encuentren en cantidades elevadas. Se ha reportado que la presencia significativa de iones cloruros o iones ferrosos sobreestimarían el monóxido de carbono (CO) mientras que los nitratos provocarían el efecto inverso dando valores bajos de CO [16]. En cuanto al nitrato sólo interfieren cuando la concentración excede el 5 % del contenido de carbono. Por otro lado, la presencia de calcáreo en los suelos podría neutralizar la acidez del medio, pero algunos ensayos con contenidos de carbonates de hasta el 50% p/p no afectan la determinación [16].
Cuenta total de microorganismos mesófilos
Los suelos son ecosistemas naturales con altas concentraciones de metales pesados como níquel, cromo y cobalto, además de una baja concentración de micronutrientes como fósforo, nitrógeno, potasio, calcio y altos niveles de erosión. Esto hace que dichos ambientes sean considerados extremos para muchas especies de microorganismos y plantas. En esto radica la importancia de identificar y caracterizar microorganismos capaces de resistir la presencia de níquel, podrían considerase buenos candidatos para procesos de biorremediación de suelos contaminados por metales pesados [19, 20]. La resistencia de las bacterias a metales pesados está dada por la intervención de múltiples sistemas genéticos con especificidad de sustrato diferentes, pero que comparten las mismas funciones. Estos sistemas están ampliamente distribuidos y contribuyen en la defensa elemental de la célula frente a metales potencialmente dañinos, así como frente a las especies que estos producen al interactuar con los componentes celulares [20]. Por otro lado, existen otros sistemas de resistencia muy especializados y se encuentran solo en algunas especies bacterianas, confiriéndoles la capacidad de resistencia a metales pesados [20]. Los géneros Alcaligenes, Klebsiella, Arthrobacter, Pseudomonas, Acinetobacter, Enterobacter, Serratia y Acidiphilum, son los géneros con resistencia a níquel y cobalto más referidos [21, 22].
La mayoría de los genes involucrados en los mecanismos de resistencia a metales se localizan en plásmidos por lo que la selección de nuevos géneros bacterianos con resistencia a níquel y cobalto puede estar dado por la característica de los plásmidos de transferirse de una cepa a otra, lo que posiblemente indica que faltó tiempo para de adaptación de la cepa ensayada [21, 22, 23].
La cepa P. putida KT2440, es una cepa ambiental ampliamente estudiada por su versatilidad metabólica y sus capacidades de resistencia y degradación de contaminantes, tanto orgánicos, como por su resistencia a metales pesados [18]. Está ampliamente reportado que varias cepas del Pseudomonas son capaces de sintetizar fitohormonas que estimulan el crecimiento vegetal, como las auxinas, que estimulan el desarrollo radicular [26]. Además, se ha demostrado que la respuesta a estrés de las plantas a metales pesados está mediada por fitohormonas como el ácido giberélico [25].
El conteo por método estándar de microorganismos mesófilos en cada uno de los ensayos arrojó que existen poblaciones fúngicas resistentes a la concentración de níquel, por otro lado, se detectaron en menor densidad cepas bacterianas, y únicamente en los ensayos de suelo contaminado con níquel tratado con la M. sativa, y en el ensayo tratado con M. sativa y KT2440. Esto puede deberse a que la interacción microorganismo- planta, en este caso, de la cepa KT2440, capaz de colonizar la rizósfera de plantas, pudo generar alguna relación simbiótica, sin embargo, hacen falta ensayos para poder concluir esto [24].
Por otro lado, la alta densidad poblacional de hongos detectada en los ensayos de suelo directamente evidenció que existen una gran cantidad de hongos con capacidad de resistir a altas concentraciones de níquel. La presencia de estos microorganismos posiblemente se debió a que los sistemas experimentales se tenían en zonas abiertas y estos hongos encontraron condiciones propicias para su desarrollo por lo que fácilmente se establecieron.
Supervivencia de M. sativa en el sistema de biorremediación
M. sativa ha sido catalogada como una planta capaz de establecer relaciones benéficas con rizobios y bacterias consideradas como promotoras crecimiento, además de que es considerada una planta hiperacumuladora. Es por esto por lo que fue propuesta como modelo para propuesta de biorremediación [32, 33, 34]. Por otro lado, la capacidad de resistencia de las plantas al estrés provocado por metales pesados se ve influenciado por el estadio de la planta, la edad, la presencia de fitohormonas, como el ácido giberélico, que inhibe efectos causados por metales pesados en germinados de plantas de arroz [25]. Por lo tanto, es posible que la presencia de dicha hormona no se encuentre en la concentración suficiente como para inhibir algunos efectos nocivos sobre la planta, pues en este estadio de desarrollo, son las auxinas las que llevan a cabo un rol muy importante en el desarrollo de la plántula, y debido a que la cepa P. putida KT2440 es productora de auxinas como la hormona ácido-3-indolacético, se esperaría que la planta pudiera tener un mejor desarrollo, sin embargo, como la cepa bacteriana no se detectó posterior a la inoculación en ninguno de los ensayos inoculados con la cepa, se sugiere que no logró existir un establecimiento de la cepa bacteriana con M. sativa por lo que no sobrevivió a las condiciones de contaminación a esa concentración, por lo tanto, no hubo un desarrollo óptimo de la plántula [26, 35].
Concentración de níquel
La solubilidad de los metales depende de las características de suelo y están influenciadas directamente por el pH, este tiene un efecto en la movilidad de los metales pesados dentro del suelo, bajo condiciones ácidas los metales son más móviles y por tanto más disponibles y al contrario, en condiciones básicas los cationes son adsorbidos a la superficie mineral o precipitados disminuyendo así la biodisponibilidad de los metales; aunado a esto los metales del suelo existen como iones metálicos libres y compuestos metálicos solubles; como iones intercambiables adsorbidos a las superficies de la fase sólida inorgánica o como iones no intercambiables y precipitados; o en compuestos metálicos intercambiables insolubles [1]. Se considera que por esta razón el suelo que se contaminó se encontró con concentraciones iniciales diferentes ya que además en el primer ensayo mostrado en la tabla 7 se tuvo un filtrado casi total de la solución contaminante, haciendo así la concentración de metal en suelo menor a los otros ensayos.
La fitoextracción resulta una técnica útil que utiliza variedades de plantas hiperacumuladoras para transferir elementos traza de suelos contaminados a la parte aérea de la planta. La especie M. sativa se considera una planta hiperacumuladora [17], se encontraron estudios que reportan la concentración máxima de níquel en valores similares a la norma que esta planta puede tolerar [6], se considera que es por esta razón que en los ensayos Níquel + M. sativa y Níquel + M. sativa + P. putida KT2440,sin embargo, no logró sobrevivir de estos germinados y en su lugar se observó el crecimiento de un hongo grisáceo no identificado en la atenuación del metal pesado, ya que se tuvo una disminución del 42.11% y 99.26% respectivamente respecto a la concentración inicial de níquel cuantificada en el suelo.
Algunos microorganismos pueden ser capaces de alterar el estado químico, la forma o distribución de metales en el suelo, las bacterias tienen en general una amplia capacidad para acumular metales en su biomasa, en este estudio la cepa P. putida KT2440 no sobrevivió a los ensayos níquel + M. sativa + P. putida KT2440 y níquel + P. putida KT2440 sin embargo este último logró una disminución del 99.46% del metal.
CONCLUSIONES
M. sativa no puede desarrollarse en un sustrato contaminado con altas concentraciones de níquel, bajo las condiciones experimentales evaluadas, de la misma manera, la cepa de P. putida KT2440 no fue capaz de permanecer ni asimilar el níquel, a pesar de que no se utilizó la mayor concentración de Ni permitida por la norma (20 OOO ppm), esto nos indica que habría que evaluar los valores que la norma refiere ya que la cepa bacteriana? utilizada en estos ensayos se considera altamente resistente a factores similares a los que fue expuesta .
Sin embargo, se observó establecimiento, crecimiento y proliferación de hongos en todos los tratamientos, asimismo en los ensayos de monitoreo de níquel por absorción atómica, se observó una disminución de la concentración de éste, lo cual podría ser atribuible a la presencia de dichos hongos.
A diferencia de las variables evaluadas en un principio, se desarrollaron hongos que, adaptándose a las condiciones expuestas en los ensayos, no solo sobrevivieron si no que lograron la mayor disminución del metal.
Los microorganismos cuentan con capacidades metabólicas diversas que les permiten utilizar diferentes tipos de sustratos, los metales pesados son sustratos que pueden ser transformados a compuestos más estables o menos tóxicos por estos organismos, gracias a esta capacidad se han podido implementar técnicas de biorremediación con el fin de reducir la carga contaminante de un ambiente o ecosistema.
Podemos observar que el sistema propuesto no se acoplo en el tiempo establecido, pero se da pauta a establecer un nuevo sistema biorremediador con presencia del hongo adaptado a estas concentraciones de níquel y que funcional con una eficiencia de remoción del metal hasta de un 99.4%.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
REFERENCIAS
[6]. Quni E, Dodona E, Harasani P, Sallaku F, Shallari S. Assessment of Habitats Area Sand Nickel Hyperaccumulator Plant Alyssum genus in Albania. Albanian Journal of Agricultural Sciences [Internet]. 2015 Oct [cited 2019 Jun 25]; 14(4):374-80.
[13]. Sánchez-Yáñez, J. M., Alonso-Bravo, J. N., Dasgupta-Schuber, N., Márquez-Benavides, L. Biorremediación de suelo contaminado con 55000 y 65000 de aceite residual automotriz y fitorremediación con Sorghum bicolor inoculado con Burkholderia cepacia y Penicillium chrysogenum. [Internet]. Journal of the Selva Andina Biosphere, 3(2), 86-94. 2015. [Cited 1 April 2019].
[24]. Matilla Vázquez, M. Á. Análisis genómico y funcional de la interacción Planta-Pseudomonas putida KT2440 en la rizosfera: colonización y resistencia sistémica. [Internet]. 2009 [Cited 10 April 2019].
[33]. Peña-Salamanca E. J., Madera-Parra C., Sánchez, 1, Medina-Vásquez J. Bioprospección de plantas nativas para su uso en procesos de biorremediación: caso Helicona psittacorum (Heliconiacea). [Internet] Rev. Acad. Colomb. Cieñe, 37(145). 2013 [Cited 30 April 2019]