AyT BUAP - Extractos acuosos de plantas como inhibidores de la germinación de uredinio

Extractos acuosos de plantas como inhibidores de la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix; la roya anaranjada del café

José Antonio García-Pérez¹* iD, Enrique Alarcón-Gutiérrez² iD, Vianey del Rocio Torres Pelayo¹ iD

¹Facultad de Biología, Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, México. Circuito Gonzalo Aguirre Beltrán s/n, Zona Universitaria C.P. 91090, Xalapa, Veracruz, México. ²Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada (INBIOTECA), Universidad Veracruzana. Av. De las Culturas Veracruzanas No. 101 Col. Emiliano Zapata C. P. 91090 Xalapa, Veracruz, México. *antoniogarcia01@uv.mx; garci95@hotmail.com

http://doi.org/10.5281/zenodo.5104813

Bajar cita (RIS): García-Pérez y cols., 2021 AyTBUAP 6(21): 45-60

Editado por: Jesús Muñoz-Rojas (Instituto de Ciencias-BUAP)

Fecha de publicación: 28 marzo 2021

EOI: https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.21.04

URI: https://hdl.handle.net/20.500.12371/11857

Referencia: García-Pérez J-A, Alarcón-Gutiérrez E, Torres Pelayo V del R. Extractos acuosos de plantas como inhibidores de la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix; la roya anaranjada del café. Alianzas y Tendencias BUAP [Internet]. 2021;6(21):45–60. Available from: https://drive.google.com/file/d/1EwNETNjHTsojNvFk85gIAxsJlZkTu4eK/view

RESUMEN

El objetivo de este estudio fue probar el efecto inhibidor de extractos acuosos de tres especies de plantas sobre la germinación de urediniosporas de la roya del cafeto (Hemileia vastatrix). Se prepararon extractos acuosos de hojas de Ardisia compressa and Eriobotrya japonica comunes en cafetales del centro de Veracruz, México, y de hojas de Ocimun basilicum, común en los jardines caseros locales. Se realizaron tres ensayos experimentales, uno con el extracto de cada especie vegetal, bajo un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos; el control negativo (extracto 0%), el control positivo (fungicida comercial), el extracto al 75% y el extracto al 100%. La variable de respuesta fue la proporción de urediniosporas germinadas y la variable explicativa fue la concentración de extracto. Para los resultados de cada ensayo, se ajustó un Modelo Lineal Generalizado (GLM), con errores binomiales, usando el lenguaje R. Los resultados indicaron que los extractos de las tres especies de plantas inhibieron totalmente la germinación de las urediniosporas a un nivel similar al del fungicida comercial. A pesar de la baja tasa de germinación de urediniosporas en los controles negativos, su tasa de germinación fue estadísticamente más alta (P < 0.01) que la de los otros tratamientos. Por lo tanto, se concluye que los extractos de las tres especies vegetales tienen un gran potencial para su uso en el control ecológico de la roya del cafeto. Sin embargo, se necesita escalar los experimentos, tanto a nivel de invernadero como de campo, y probar con surfactantes, coadyuvantes y estabilizadores.

Palabras clave: Extractos acuosos; Ardisia compressa; Eriobotrya japonica; Ocimun basilicum; fitoquímica; roya del cafeto.

ABSTRACT

The aim of this study was to test the inhibitory effect of plant aqueous extracts on the urediniospores germination of the coffee rust (Hemileia vastatrix). Aqueous extracts were prepared from leaves of Ardisia compressa and Eriobotrya japonica which are commons in coffee plantations in central Veracruz, Mexico, and from leaves of Ocimun basilicum, which is common in local home gardens. Three experimental trials were carried out, one with the extract of each plant species under a completely randomized design with four treatments; the negative control (extract 0%), the positive control (commercial fungicide), and extracts at 75% and 100%. The response variable was the proportion of germinated urediniospores and the explanatory variable was the extract concentration. A Generalized Linear Model (GLM) with binomial errors was fitted for data of each experiment using the R software. The results indicated that extracts of the three plants species, totally inhibited the germination of urediniospores at a similar level to that of the commercial fungicide. In spite of low germination rate of urediniospores in negative controls, it was statistically higher (P < 0.01) than that of the other treatments. Therefore, it is concluded that extracts of three plant species have a great potential to be used in the ecological control of coffee rust. However, experiments need to be scaled up at the greenhouse and field level and testing with surfactants, adjuvants, and stabilizers.

Keywords: Aqueous extracts; Ardisia compressa; Eriobotrya japonica; Ocimun basilicum; phytochemistry; coffee rust.

INTRODUCCIÓN

La roya del café (RC) es causada por el basidiomiceto del orden Pucciniales, Hemileia vastatrix, que es un hongo biotrófico obligado que se encuentra en casi todos los países productores de café y ha impactado negativamente la producción de este cultivo desde fines del siglo XIX [1]. La RC se considera la más destructiva de todas las enfermedades foliares de plantas de café en el mundo [2, 3, 4, 5] y es uno de los principales factores limitantes para el cultivo de la especie de café arábigo (Coffea arabica) [6], la cual representa aproximadamente el 70 % de la producción mundial [7]. La RC ha producido pérdidas de entre uno y dos mil millones de dólares estadounidenses al año [1]. La roya se dispersa a través de urediniosporas que infectan a las hojas de la planta de café por aire y por gotas de lluvia; una vez en la hoja, las urediniosporas germinan y entran por las estomas de las hojas mediante hifas germinativas, iniciando así el proceso de infección [10, 11, 12]. La enfermedad se manifiesta por la aparición de manchas amarillas o de color naranja [8] en las hojas (Fig. 1a) y, en ausencia de un manejo adecuado, produce hasta un 50% o más de pérdida de hojas (Fig. 1b) lo que puede conducir a la muerte de las plantas de café [9]. El desarrollo de cultivares resistentes a la RC se considera actualmente la estrategia más eficaz para su control, sin embargo, el desarrollo de líneas resistentes requiere entre 25 y 30 años.

Figura 1. Observación de signos y efectos de la roya del cafeto; a) lesiones de color amarillo que manifiestan las pústulas de urediniosporas de H. vastatrix en las hojas de las plantas; y b) la defoliación causada en los estados avanzados de la enfermedad. Las imágenes fueron tomadas en el ejido de San Marcos de León, Municipio de Xico, Veracruz, México.

Además, la calidad del café es inferior a los cultivares tradicionales [13]. Otra solución a corto plazo ha sido el uso de fungicidas sintéticos a base de cobre [14]; sin embargo, existe evidencia de que estos fungicidas han ido perdiendo efectividad debido a la adquisición de resistencia por parte del hongo, con el incremento en la frecuencia de las aplicaciones y el consecuente incremento en el riesgo de generar problemas de contaminación y para la salud humana [15, 16]. Una alternativa natural y más amigable ambientalmente para el control de la RC, es el uso de metabolitos secundarios (MS) que se encuentran en las plantas [17], los cuales han mostrado actividad plaguicida [18, 19]. Un grupo de MS importantes son las fitoalexinas que se sintetizan en respuesta a la presencia de un patógeno. Estos son compuestos fenólicos [20] que incluyen terpenos, polifenoles, glucósidos y alcaloides [21, 22], los cuales han mostrado propiedades antimicrobianas, antibacterianas, fungicidas o fungistáticas en una variedad de patógenos [23, 24]. Hay pocos estudios disponibles sobre la efectividad de extractos de plantas para la inhibición de la germinación de urediniosporas de H. vastatrix (roya), pero estudios con otras especies de roya indican el potencial que podrían tener en el caso de la roya del café. Por ejemplo, fue posible reducir la incidencia de la roya de la morera (Cerotelium fici), entre un 33 y un 73% utilizando extractos acuosos de neem (Azadirachta indica), papaya (Carica papaya), albahaca morada (Oscimum sanctum), chancapiedra (Phyllanthus niruri) y el árbol casto (Vitax nigundo) [25]. Los extractos acuosos de rizoma de jengibre (Zingiber official), bulbo de cebolla (Allium cepa) y bulbo de ajo (Allium sativum) redujeron la incidencia de roya del trigo (Puccinia recondita f.sp. tritici) entre un 55 y un 60%. Asimismo, fue posible inhibir en más del 93%, la germinación de las urediniosporas de la roya del trigo (Puccinia triticina) utilizando extractos acuosos de ajo, clavo, quinina de jardín, pimienta brasileña, anthi mandhaari, comino negro, cedro blanco y neem [26]. Similarmente, el licor de roble tuvo una eficiencia del 74,4% para abortar las pústulas de la roya de la Perilla (Perilla frutescens) [27]. En cuanto a los escasos estudios con la roya del café, Salustiano et al. [28] lograron la inhibición total de la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix mediante el uso de extractos acuosos y metanólicos de hojas de lámpara (Eremanthus erythropappus). Subramani et al. [19] obtuvieron una inhibición de entre el 51 y el 74% de la roya del café utilizando extractos acuosos de hojas frescas de vasaka (Adhatoda vasica), neem, cinco negritos (Lantana camara) e higuerilla (Ricinus communis). Con estos mismos extractos, los autores también alcanzaron a reducir en el campo, entre un 20 y un 35%, la incidencia de la roya del café. Finalmente, Mudyiwa et al. [29] mostraron que los extractos acuosos de moringa (Moringa oleifera) y zacate limón (Cymbopogon citratus) fueron efectivos en el control de la germinación de las urediniosporas de la roya del café. Esta investigación, tuvo como objetivo probar la capacidad de extractos acuosos de hojas de níspero (Eriobotrya japonica), capulín (Ardisia compressa) y albahaca (Ocimum basilicum), para inhibir la germinación de urediniosporas de la roya del café.

METODOLOGÍA

Colecta de material vegetal

El material vegetal para la elaboración de los extractos fue recolectado en cafetales de sombra del ejido de San Marcos de León, Veracruz, México (Longitud: -96.963611, Latitud: 19.422778). Las características de las plantas elegidas fueron: hojas cerosas gruesas, sin daño visible por hongos o herbívoros, bajo el supuesto de que sería indicativo de la presencia de sustancias antifúngicas o antibióticas. Se recolectaron cerca de 800 g de hojas de Ardisia compressa, Eriobotrya japonica y Ocimun basilicum y se trasladaron al laboratorio en bolsas de papel. El material vegetal de cada especie se limpió con una solución de hipoclorito de sodio (Cloralex™) (10%), se enjuagó con agua destilada y se secó durante 24 h a 60 ºC. Luego, el material seco se molió y se pasó a través de un tamiz de luz de malla 0.5 mm y se almacenó en frascos de color ámbar. Este material se mantuvo almacenado a temperatura ambiente en un lugar seco hasta su uso en los ensayos.

Extractos acuosos

Los extractos acuosos de las tres especies se obtuvieron según Kobayashi y González de Mejía [30]. Doscientos mililitros de agua destilada se llevaron a punto de ebullición y se dejaron evaporar hasta reducir a 175 ml. Luego, se agregaron 12.5 g de material vegetal seco y la infusión se mantuvo en punto de ebullición durante 10 segundos y posteriormente se mantuvo en reposo durante 60 segundos. El líquido resultante se centrifugó a 5000 rpm durante 15 minutos para decantar los sólidos o residuos remanentes. La infusión se filtró dos veces utilizando papel filtro Whatman de 0.8 mm y 2 μm, respectivamente. El extracto así obtenido se almacenó en refrigeración (4 °C), se protegió de la luz hasta su uso y análisis, y se consideró la base de 100% en concentración para elaborar el tratamiento al 75% de concentración.

Caracterización fitoquímica cualitativa

La determinación de la presencia de alcaloides, flavonoides, terpenos y saponinas, se hizo por triplicado mediante el uso de las técnicas colorimétricas propuestas por Domínguez [31]. Los alcaloides se determinaron mediante las técnicas de Mayer, Dragendorff y Wagner, los flavonoides con las pruebas de Shinoda, Cloruro Férrico (FeCl3) y Ácido Sulfúrico (H2SO4), los terpenos se determinaron mediante la prueba de Liebermann-Burchard, mientras que las cumarinas se detectaron con las pruebas de KOH y rayos UV. Finalmente, la presencia de saponinas se determinó mediante la prueba de la espuma y con el reactivo de Rosenthaler.

Colecta de urediniosporas de Hemileia vastatrix

Las urediniosporas de roya para los ensayos, se recolectaron de plantas de Coffea arabica variedad típica. Las urediniosporas presentes en las manchas color naranja de las hojas de café se barrieron con un pincel y se depositaron en un microtubo. Los ensayos con cada extracto de planta no se llevaron a cabo simultáneamente, por lo que se utilizó un lote de urediniosporas recién recolectadas en cada ocasión para evitar problemas con el almacenamiento y la viabilidad de las mismas.

Ensayos de inhibición de germinación de urediniosporas

Se realizó un ensayo experimental de inhibición de germinación de urediniosporas con el extracto acuoso de cada especie vegetal. Se probaron tres concentraciones de extracto de cada especie: 0.0%, 75% y 100%, más un control positivo que contenía fungicida comercial (oxicloruro de cobre 50% polvo mojable) con base en la dosis recomendada (3.7 g/L). Los extractos acuosos se diluyeron con agua destilada y esterilizada para la conformación del tratamiento al 75%.

Aproximadamente 1.5 ml de agua destilada, extracto puro o extracto diluido, y agua destilada más fungicida comercial, se depositaron en microtubos (2 ml) a los cuales se les añadieron, aproximadamente, 0.04 g de urediniosporas recién colectadas de roya del café. La cantidad de urediniosporas en peso se determinó mediante pruebas repetidas, hasta que alícuotas tomadas de la dilución de urediniosporas en 1.5 ml resultaron en la cuantificación efectiva y en la visibilidad clara de los tubos de germinación en cámaras de Neubauer. Cada tratamiento consistió, para el caso del ensayo con Ardisia compressa, de ocho réplicas, y para Eriobotrya japonica y Ocimun basilicum, cuatro réplicas respectivamente. La diferencia en el número de réplicas se debió a la disponibilidad de las urediniosporas en ese momento. Los microtubos de cada ensayo se colocaron en gradillas y se incubaron durante 24 horas a 24 °C en condiciones de oscuridad total [32, 33].

Conteo de urediniosporas

Después de 24 h, las urediniosporas germinadas y no germinadas se contaron auxiliados de un hemocitómetro (cámara de Neubauer, Thermo Fisher). Para ello, se tomaron muestras y se procesaron tres alícuotas de cada réplica. Dentro del hemocitómetro, se contaron las urediniosporas germinadas y no germinadas que cayeron dentro del área de los cinco cuadrados. Las urediniosporas se consideraron como germinadas cuando se observó claramente, bajo el microscopio a 40X, el desarrollo de uno o más tubos de germinación (Fig. 2) y se consideraron como no germinadas cuando los tubos de germinación no fueron observados.

Análisis de datos

Los datos de cada ensayo se analizaron mediante un Modelo Lineal Generalizado (GLM) con errores binomiales [34] para determinar los efectos significativos de los tratamientos. Los análisis se realizaron con el software R [35]. La siguiente relación se utilizó para obtener la devianza explicada (D²) por cada uno de los modelos ajustados.

D² = [(𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑛𝑢𝑙𝑎−𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙) / 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎 𝑛𝑢𝑙𝑎]∗100 [36]

Figura 2. Aspectos del desarrollo de tubos germinativos en urediniosporas del hongo H. vastatrix a 40X.

RESULTADOS

Caracterización fitoquímica de los extractos acuosos

Para el extracto de hojas de A. compressa se detectó una presencia alta de alcaloides y flavonoides (Cuadro 1) por medio de las técnicas de Dragendorff y Cloruro Férrico (FeCl3) respectivamente. Las cumarinas se registraron débilmente y no se detectaron saponinas ni terpenos. En cambio, para el extracto de E. japonica, se evidenció una presencia fuerte de alcaloides y cumarinas, mientras que la presencia de flavonoides fue débil y no se detectaron terpenos ni saponinas. Finalmente, para el extracto de O. basilicum se detectó una presencia fuerte de alcaloides, flavonoides y terpenos, mientras que la presencia de cumarinas fue moderada y no se detectaron saponinas.

Germinación de urediniosporas

Todos los ensayos con extractos acuosos de hojas de las tres especies vegetales mostraron un efecto inhibidor sobre la germinación de urediniosporas de la roya del cafeto Hemileia vastatrix. La proporción promedio de urediniosporas germinadas en el control negativo (agua destilada) fue baja para los ensayos de las tres especies; es decir, 27.8 ± 4.5 para E. japonica (Fig. 3a); 13.029 ± 3.59 para A. compressa (Fig. 3b); y 4.43 ± 0.35 para O. basilicum (Fig. 3c). Sin embargo, la proporción de urediniosporas germinadas en este tratamiento (i.e., control negativo), fue la más alta estadísticamente en todos los ensayos (Fig. 4). Los modelos ajustados predijeron una alta proporción de urediniosporas germinadas en cada ensayo; 96.75% para E. japonica (Fig. 4a), 83.11% para A. compressa (Fig. 4b) y 85.01% para O. basilicum (Fig. 4c). (Figs. 4a, 4b y 4c respectivamente).

Figura 3. Efectos observados de extractos acuosos de hojas de: a) E. japonica, b) A. compressa, y c) O. basilicum sobre la germinación de urediniosporas de roya del cafeto H. vastatrix. CN and CP representan el control negativo (agua), y el control positivo (fungicida comercial), respectivamente. Los datos son la mediana, el primer y tercer cuartil, más la dispersión.

Cuadro 1. Análisis fitoquímico cualitativo de extractos acuosos de hojas de A. compressa, E. japonica and O. basilicum.

DISCUSIÓN

El presente estudio tuvo como objetivo principal evaluar la efectividad de tres extractos acuosos de hojas de Eriobotrya japonica, Ardisia compressa, y Ocimun basilicum, plantas provenientes de cafetales del centro de Veracruz, para la inhibición de la germinación de urediniosporas de la roya del cafeto Hemileia vastatrix. Los resultados más importantes indicaron que los extractos acuosos de Eriobotrya japonica, Ardisia compressa y Ocimun basilicum redujeron la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix a sólo 0.12, 0.34 y 0.38 % respectivamente, en promedio. Todos estos efectos fueron estadísticamente significativos (P < 0.001) con respecto al tratamiento control de cada especie. Hay pocos estudios disponibles para la comparación de los resultados sobre la inhibición de urediniosporas de H. vastatrix utilizando extractos acuosos de plantas. Sin embargo, Salustiano et al. [28], obtuvieron un 100% de inhibición en la germinación de urediniosporas de varias especies de roya (incluyendo urediniosporas de Hemileia vastatrix), utilizando extractos acuosos y metanólicos de hojas de Eremanthus erythropappus. Del mismo modo, Mudyiwa et al. [29], lograron reducir entre 84 y 100 % la germinación de urediniosporas de H. vastatrix utilizando extractos acuosos de hojas del “limoncillo”, Cymbopogon citratus, (a concentraciones de 25%, 50%) y de hojas de Moringa oleifera (a 50 y 100% de concentración).

Figura 4. Modelos y predicciones del efecto de tratamientos de extractos acuosos de hojas de: a) E. japonica, b) A. compressa, y c) O. basilicum sobre la germinación promedio de urediniosporas de roya del cafeto H. vastatrix. CN and CP representan el control negativo (agua), y el control positivo (fungicida comercial), respectivamente. Letras diferentes indican diferencias significativas a P < 0.001.

La germinación de urediniosporas de otras especies de roya también ha sido inhibida con éxito por extractos acuosos de plantas, tal es el caso de las urediniosporas de la roya del trigo, Puccinia triticina, que fueron inhibidas por extractos acuosos de Jacaranda mimosifolia (Bignoniaceae), Thevetia peruviana (Apocynaceae) y Calotropis procera (Apocynaceae) en una proporción del 97%, 78% y 53% respectivamente [37]. En otro estudio, una concentración de 50 μg/ml de licor de roble piroligno, cuyo principal componente es un antimicrobiano (o-metoxifenol o guayacol), fue suficiente para lograr un 74% de aborto de las pústulas de la roya de la Perilla (Perilla frutescens, Lamiaceae) [27]. En otros estudios utilizando extractos vegetales contra otro tipo de hongos distintos de las royas, (Mycosphaerella fijensis Morelet) se ha logrado una actividad inhibidora en la reproducción del hongo, y esto se ha atribuido a la presencia de alcaloides, esteroides, fenoles, flavonoides y de saponinas [38]. En nuestro estudio, el análisis fitoquímico cualitativo indicó la presencia de alcaloides, flavonoides y cumarinas en las tres especies, mientras que sólo se registraron terpenos en Ocimum basilicum. Las saponinas no se registraron en ninguna especie. En otros estudios fitoquímicos más precisos que el nuestro, se han reportado una variedad de sustancias en las tres especies estudiadas. Por ejemplo, para A. compressa, se ha reportado la presencia de polifenoles, ácido gálico, péptidos, saponinas, isocumarinas, quinonas, alquifenoles, bergenina, ardisina y derivados de bencenina, embelina, quercetina, ardisenona, ardisiaquinona, ardisianona y norbergenina ([30, 39], y se ha señalado que aunque algunos de estos componentes se encuentran en otras plantas, la combinación única de varios compuestos en esta especie, es lo que produce una fuente tan novedosa de agentes fitoquímicos [30] en otras especies del género Ardisia (e.g., A. crispa, Thunb) [40]. Asimismo, se ha determinado que las hojas de Eriobotrya japonica Lindl., son una fuente de activos fenólicos, siendo las hojas jóvenes las que contienen mayor cantidad de fenoles totales [41]. Otros compuestos fitoquímicos que se han encontrado en las hojas de esta especie son terpenos, triterpenos, sesquiterpenos, flavonoides, taninos y glucósidos [42, 43, 44, 45, 46] y se ha determinado una actividad antimicrobiana y antifúngica para algunos de ellos [43]. Finalmente, para Ocimum basilicum, L., Lamiaceae, especie de gran uso tradicional, se han encontrado más de 200 compuestos químicos. En esta especie se han encontrado compuestos tales como polifenoles, alcaloides, taninos, hidrocarburos monoterpénicos, mono terpenos oxigenados, hidrocarburos sesquiterpénicos, sesquiterpenos oxigenados, triterpenos, flavonoides, cumarinas, glucósidos de saponina, esteroides, compuestos aromáticos y ácido ascórbico; y para algunos de ellos se les han determinado propiedades antibacterianas, anti fúngicas, antivirales, antisépticas e insecticidas [47, 48, 49].

CONCLUSIÓN

Los extractos acuosos de hojas de las tres especies redujeron la germinación de urediniosporas de Hemileia vastatrix a valores que variaron de 0.12 a 0.38 %, lo cual indica prácticamente una inhibición total. Por tanto, los extractos acuosos de estas especies representarían una alternativa para el control de la roya, sin embargo, son necesarios más estudios para el escalamiento en experimentos de invernadero y de campo. Además, para el escalamiento será importante la experimentación con surfactantes y coadyuvantes agregados a los extractos para su mejor dispersión, mojamiento, humectación, penetrabilidad, adherencia y estabilidad del extracto.

CONFLICTO DE INTERÉS

Los autores declaran que no tienen intereses económicos en competencia, o relaciones personales, que pudieran haber influido en el trabajo informado en este documento.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos el apoyo técnico de la bióloga Patricia del Carmen Gómez en la preparación de los materiales y extractos para los ensayos experimentales y en la revisión de los mismos. Asimismo, se agradece la participación del biólogo Luis Salvador Aragón Hernández García en la colecta, secado, molido y tamizado del material biológico, en los análisis fitoquímicos y en la revisión de los ensayos experimentales. Finalmente, también agradecemos a la bióloga Vanessa Alarcón Córdova por su apoyo en los análisis fitoquímicos.

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