Caracterización de cepas rizosféricas pertenecientes al género Paraburkholderia sp. aisladas de la sierra norte del Estado de Puebla

Itzia Citlali Guevara-González¹ iD, Ricardo Carreño-López² iD, Luis Ramiro Caso-Vargas¹ iD, Vianey Marín-Cevada²* iD

¹Facultad de Ciencias Biológicas, Biotecnología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Puebla, México. ²Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Edificio IC-11, Ciudad Universitaria, San Manuel, Puebla, México. C. P. 72570. *vianey.marin@correo.buap.mx

http://doi.org/10.5281/zenodo.5105190

Bajar cita (RIS): Guevara-González et al., 2021 AyTBUAP 6(22): 54-75

Editado por: Jesús Muñoz-Rojas (Instituto de Ciencias BUAP)

Fecha de publicación: 09 mayo 2021

EOI: https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.06.22.03

URI: https://hdl.handle.net/20.500.12371/13167

Referencia: Guevara-González IC, Carreño-López R, Caso-Vargas LR, Marín-Cevada V. Caracterización de cepas rizosféricas pertenecientes al género Paraburkholderia sp. aisladas de la sierra norte del Estado de Puebla. Alianzas y Tendencias BUAP [Internet]. 2021;6(22):54–75. Available from: https://drive.google.com/file/d/1Az52KkAPGR5iWM9g5IJw075RtQj33rlk/view

RESUMEN

El género Paraburkholderia comprende más de 100 especies, las cuales pueden ser aisladas de diversos ambientes como plantas, suelos agrícolas, suelos volcánicos e incluso, a partir de cuerpos de agua. Existen pocos estudios en nuestro país que reportan el aislamiento de miembros pertenecientes a este género. En éste trabajo, se estudió la posición taxonómica de siete cepas rizosféricas pertenecientes al grupo de Burkholderia sensu lato, aisladas en el municipio de Chignahuapan del estado de Puebla de árboles maderables como el pino y de plantas silvestres como los helechos y las bromelias, utilizando un enfoque taxonómico polifásico. Con base en las secuencias de los genes ARNr 16S, atpD y recA se confimó que todas las cepas pertenecen al género Paraburkholderia y que GB45, GB51, GB53, GB62, GB152 y GB203 forman un clúster con Paraburkholderia sediminicola y Paraburkholderia aspalathi, con excepción de la cepa GB190, la cual podría representar una nueva especie al separarse de este grupo como lo demuestran los árboles filogenéticos. Con respecto a la caracterización fenotípica, las siete cepas de Paraburkholderia mostraron un crecimiento óptimo a una temperatura de 35 °C y un pH 6 en ausencia de NaCl. La tolerancia a distintas concentraciones de metales pesados (Co, Pb, Mo, Ni, Zn y V) fue diversa, así como en las pruebas de antibióticos. La cepa GB51 fue la única que creció en presencia de zinc hasta 200 ppm y en vanadio hasta 50 ppm, mientras que la cepa GB190 no creció a 39 °C y a un pH 4 pero fue la única cepa que si lo hizo en presencia de gentamicina a una concentración de 1 µg/mL y kanamicina a 2.5 µg/mL, estas características fueron las que la diferenciaron del resto de los aislamientos.

Palabras clave: Burkholderia sensu lato; metales pesados; resistencia a antibióticos; filogenia; árboles maderables; plantas silvestres.

ABSTRACT

The genus Paraburkholderia comprises more than 100 species, isolated from various environments such as plants, agricultural soils, volcanic soils, and even water bodies. Few studies in our country report the isolation of members belonging to this genus. In this work, we focus on the taxonomic position of seven rhizospheric strains belonging to the Burkholderia sensu lato group, all of them were isolated from timber trees such as pine and wild plants such as fern and bromeliads, in the municipality of Chignahuapan situated in the state of Puebla using an approach polyphasic taxonomic. Based on the sequences analysis of the 16S rRNA, atpD, and recA genes confirmed that all the strains belong to the genus Paraburkholderia, even GB45, GB51, GB53, GB62, GB152, and GB203 form a cluster with Paraburkholderia sediminicola and Paraburkholderia aspalathi, except for the GB190 strain, which might represent a new species of this genus because it is separated from this group, as shown by phylogenetic trees. Regarding the phenotypic characterization, the seven strains showed an optimal growth at at 35 °C and pH 6.0 in the absence of NaCl. The ability to tolerate different heavy metal concentrations (Co, Pb, Mo, Ni, Zn, and V) and antibiotics concentrations (ampicilin, gentamicin, tetracyclin, kanamycin, and chloramphenicol) was diverse. Only the GB51 strain grew in the presence of zinc (≤200 ppm) and vanadium (≤50 ppm). The GB190 strain was not able to grow at 39 °C and pH 4.0 but it was the only strain resistant to gentamicin (1 µg/mL) and kanamycin (2.5 µg/mL), characteristics that also differentiated it from the rest of the isolates.

Keywords: Burkholderia sensu lato; heavy metals; antibiotic resistance assay; phylogeny; timber trees; wild plants.

INTRODUCCIÓN

Durante muchos años se han descrito nuevas especies bacterianas basadas en el análisis de un conjunto muy limitado de aislados [1], esto debido a las deficiencias que propiciaban los estudios usados que estaban basados en caracteres morfológicos, fisiológicos (necesidad de nutrientes) y estructurales (diferencias entre lípidos de membranas) que no permitían conocer los microorganismos existentes hasta ahora. Lo anterior era cierto para muchas especies bacterianas, incluidas varias que pertenecen al grupo de Burkholderia sensu lato [2, 3]. Sin embargo, la taxonomía bacteriana cambió al adoptar una combinación de métodos para la identificación y descripción de nuevas especies basada en un enfoque polifásico de la taxonomía utilizando tres clases de métodos: fenotípico, genotípico y filogenético para complementar los problemas de agrupación y caracterización. Este enfoque ha permitido la división del género Burkholderia ahora Burkholderia sensu lato (s.l.) en seis géneros: Burkholderia sensu stricto (s.s.), Caballeronia, Paraburkholderia, Trinickia, Mycetohabitants y Robbsia mediante análisis filogenéticos de los genes ARNr 16S y de mantenimiento; secuencias de genomas y proteínas [3]. El género tipo, Burkholderia (s. l.), se encuentra constituido por más de 200 especies que habitan diferentes ambientes, como el agua y el suelo [4]. Asimismo, pueden establecer simbiosis con plantas, ya sea como endófito o desarrollando nódulos en leguminosas. También se han descrito especies que pueden comportarse como patógenas de humanos (algunas con carácter de oportunistas), de plantas y de animales [5]. Beukes y colaboradores (2017) utilizaron datos completos de las secuencias del genoma de 78 cepas tipo, mostrando, por un lado, una división formal entre las especies patógenas y las especies ambientales beneficiosas para las plantas (PBE) sobre la base de sus genomas centrales; por otro lado, resolvieron las relaciones filogenéticas y propusieron arreglos taxonómicos entre las especies de los géneros Paraburkholderia y Caballeronia. Además, a partir de este punto, sería considerado como perteneciente al grupo Burkholderia (s.l) [6]. Posteriormente, la división de este grupo fue respaldada por Estrada-de los Santos y colaboradores (2018) aclarando las posiciones de diversas cepas dentro de Burkholderia (s.l) desde un enfoque filogenómico basado en un análisis de máxima verosimilitud de genes conservados de más de 100 especies [3].

Paraburkholderia es un género de β-proteobacterias, Gram-negativas, bacilos rectos o ligeramente curvados, con uno o más flagelos polares, que aparecen por separado, en pares o en grupos. Las características morfológicas y metabólicas son similares a las del género Caballeronia. Actualmente, está compuesta por 102 especies identificadas en diversos ambientes, incluidos suelos agrícolas, suelos volcánicos, agua y plantas [7, 4]. A diferencia de las especies de Burkholderia (s.s), los miembros de Paraburkholderia no se asocian comúnmente con infecciones humanas. Además de que forman un clado monofilético dentro de la familia Burkholderiaceae, que es lo que les llevó a distinguirse como un género independiente de las especies de los géneros de Caballeronia y Burkholderia (s.s), en combinación con el hallazgo de secuencias conservadas de insertos y deleciones (Conserved Signature Indels, CSI) que son exclusivas de las especies de Paraburkholderia. Los CSI en proteínas que distinguen este género como son: transposasa A, glicosiltransferasa del grupo 1, undecaprenilfosfato glucosa fosfotransferasa y monooxigenasa 4-hidroxiacetofenona fueron descritas por Sawana y colaboradores [8]. Con respecto al contenido en C+G, los miembros de este clado asociado a plantas muestran diferencias en su genoma con respecto a miembros del género Burkholderia (s.l), oscilando la proporción de guaninas y citosinas entre 59-65%, distinguiéndose del género Burkholderia (s.l.) (fitopatógenos o patógenos oportunistas de mamíferos) que presentan un alto contenido de G+C, mayor a 65%. Además, se han reportado especies del género Paraburkholderia con potencial para el control biológico, biorremediación o bacterias que promueven fijación de nitrógeno en plantas [9]. La rizósfera es el hábitat más frecuente de Paraburkholderia [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16] y se ha especulado que tal preferencia puede estar asociada con su versatilidad catabólica que les permite degradar los exudados y otros compuestos derivados de la raíz, y así persistir en la superficie de ésta [17].

En México, se han identificado especies diazotróficas del género Paraburkholderia como P. unamae, P. xenovorans, P. tropica, y otras dos estrechamente relacionadas filogenéticamente con P. kururiensis aisladas de rizósfera y rizoplano de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum) cultivadas en Morelos y en el Estado de México; estas especies de Paraburkholderia fijadoras de nitrógeno exhibieron actividades relacionadas a biorremediación, promoción del crecimiento vegetal y control biológico in vitro. P. tropica también ha sido aislada de rizósfera, rizoplano y tejidos internos de maíz y de plantas de teocintle recolectadas de los estados de Guerrero, Veracruz, Morelos, Chiapas, Puebla y Oaxaca [10]. En 2004 se describió por primera vez la especie P. unamae que fue seleccionada de un estudio taxonómico polifásico que incluía varias cepas aisladas de la rizósfera del maíz cultivado en campos de Tlayacapan, Morelos [18]. En Oaxaca, se lograron aislar de suelo de un campo de maíz algunas cepas de Burkholderia sp. endófitas fijadoras de nitrógeno, y, además, se aislaron otras identificados como P. tropica a partir de plantas de maíz en Tlayacapan, Morelos y Coatepec, Veracruz [13].

Nuestro grupo de investigación recolectó muestras de suelos rizosféricos a partir de plantas silvestres y especies maderables en el municipio de Chignahuapan, Puebla. Antonio-Flores (2015) [19] y Cervantes-Álvarez (2016) [20], aislaron e identificaron cepas bacterianas mediante secuenciación y análisis filogenético del gen ribosomal 16S demostrando que los aislados GB45, GB51, GB53, GB62, GB152, GB190 y GB203 pertenecen al grupo Burkholderia (s.l), además, están estrechamente relacionados con las cepas tipo: Paraburkholderia sediminicola y Paraburkholderia aspalathi, aisladas de sedimento de agua dulce y de nódulos de raíces de una leguminosa, respectivamente [21, 22]. La existencia de pocos estudios que evidencien la presencia de este género asociado a un mayor número de plantas, impulsan este trabajo para ampliar el conocimiento de este género con la finalidad de elucidar que ciertas especies no solo son propias de cuerpos de agua o asociadas a leguminosas. Por lo anterior, se plantea aportar conocimiento de su presencia e identificación a través de una taxonomía preliminar de estas siete cepas, miembros del género Paraburkholderia aisladas en el Estado de Puebla, proponiéndose como objetivos: i) evaluar el crecimiento de las cepas rizosféricas de acuerdo con algunos parámetros fisicoquímicos y bioquímicos; ii) determinar el grado de tolerancia a metales pesados de las cepas rizosféricas y la resistencia antibiótica de las cepas rizosféricas; iii) identificar las cepas a partir del análisis filogenético del gen 16S y de los genes de mantenimiento: recA y atpD.

METODOLOGÍA

Material biológico

Se reactivaron las siete cepas aisladas de rizósfera de pino (GB190, GB203), y helecho (GB45, GB51, GB53, GB62) y bromelia (GB152) en medio de cultivo Luria Bertani (LB), y un medio semi-selectivo para el género Burkholderia y Pseudomonas cepacia (PCAT) [23].

Caracterización fenotípica

Se evaluó durante cinco días el crecimiento de las siete cepas bajo diferentes parámetros: temperatura (30, 35 y 39 °C, incubación 120 h), pH (4, 6, 7; incubación 72 h) y salinidad (1, 2, 3% NaCl; incubación 72 h). También se realizaron algunas pruebas bioquímicas clave para identificar cepas Paraburkholderia sp. (asimilación de carbohidratos como D-manosa, D-sorbitol, prueba citrato, oxidación D-gluconato, actividad hemoltíca). Por otro lado, se determinó el grado de tolerancia de las cepas rizosféricas a metales pesados en presencia de diferentes concentraciones de estos en agar nutritivo: Ni (25, 50, 100, 200, 250 y 300 ppm), Co (25, 50, 100 y 200 ppm), Mo (250 y 300 ppm), Zn (25, 50 100 y 200 ppm), Pb (25, 50, 100, 200, 250 y 300 pm) y V (25, 50, 100 y 200 ppm). También se probó su resistencia antibiótica: Amp (10, 20, 50, 100 y 150 μg/mL), Cm (1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 y 20 μg/mL), Gm (1, 2.5, 5 y 7.5 μg/mL), Tc (2.5, 5, 10, 15 y 20 μg/mL) y Km (1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 y 20 μg/mL). La cepa Pseudomonas putida KT2440 se utilizó como control positivo para los ensayos de tolerancia a metales y resistencia antibiótica. Todos ensayos se realizaron por triplicado.

Caracterización genotípica

Primeramente, se realizó la extracción del ADN genómico de las cepas utilizando el kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega) siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Para amplificar los genes de mantenimiento recA y atpD se utilizaron los cebadores reportados por Spilker et al., [24]: recAF (5´-AGGACGATTCATGGAAGAWAGC) y recAR (5´-GACGCACYGAYGMRTAGAACTT), atpDF (5´-ATGAGTACTRCTGCTTTGGGTAGAA GG), atpDR (5´-CGTGAAACGGTAGATGTTG TCG), generando un amplicón de 704 y 756 pb, respectivamente. La reacción consistió en 1 μl de ADN molde (26 ng) y una alícuota de 9 μl de la mezcla de PCR, que contenía buffer 1x, dNTP’s 2 mM, 1 μl de cada cebador, y 1.25U de DreamTaq DNA Polymerasa (Thermo Scientific™). Las condiciones del ciclo térmico para la PCR fueron las siguientes: 95 °C por 6 min; 29 ciclos de 94 °C por 40 s, seguido por la temperatura de alineamiento (58 °C para el gen recA y 56 °C para el gen atpD) por 50 s y una extensión de 72 °C por 1 min, y una extensión final de 75 °C por 9 min. Finalmente se verificó la amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, y luego, se procedió a cortar la banda correspondiente al tamaño del amplicón. La secuenciación se llevó a cabo en la empresa Macrogen Korean (https://dna.macrogen.com/esp/). Otras secuencias del gen ARNr 16S utilizadas en este trabajo fueron obtenidas a partir de los estudios realizados por Cervantes-Álvarez [20].

Análisis y construcción de los árboles filogenéticos

Una vez obtenido los cromatogramas de las secuencias en sentido forward y reverse de cada cepa se analizaron con el programa BioEdit ver. 7.2.5. obteniendo la secuencia consenso. Posteriormente, las secuencias consenso fueron comparadas mediante un análisis BLASTn con las secuencias contenidas en la librería de nucléotidos del GenBank. Las secuencias generadas por las cepas de estudio, así como las de las cepas tipo se alinearon y editaron utilizando el programa BioEdit ver. 7.2.5., ClustalX 2.0 [25] y GeneDoc 2.7 [26]. Las alineaciones individuales se concatenaron utilizando DnaSP v5 [27] con los parámetros establecidos. Los árboles filogenéticos fueron construidos mediante el método de inferencia de Neighbor-Joining con base en distancias maximum composite likelihood y por el método de máxima verosimilitud mediante el modelo de sustitución Tamura-Nei usando 1,000 réplicas de arranque con el programa MEGA v7 [28].

RESULTADOS

Caracterización fenotípica

Para su reactivación las colonias cultivadas en medio sólido PCAT y LB, presentaron morfología colonial blanca, cremosa y puntiforme (Figura 1). Con excepción de la cepa GB190 que, además de presentar estas tres características, se observó un halo transparente alrededor de la colonia.

Los resultados de los ensayos con respecto a la evaluación del crecimiento de las siete cepas bajo diferentes parámetros como temperatura, salinidad, pH, asimilación de carbohidratos y actividad hemolítica se muestran en la tabla 1.

Al evaluar la tolerancia a metales en las siete cepas se registraron diferentes grados de tolerancia dependiendo del metal, su concentración y de la cepa. Las siete cepas crecieron hasta una concentración máxima de níquel de 250 ppm; sin embargo, solo la cepa P. putida KT2440 (control positivo) creció bajo la concentración de 300 ppm. Para el cobalto, las siete cepas solo fueron capaces de crecer en presencia de 25 y 50 ppm, y la cepa control positivo en 100 ppm pero no a 200 ppm. En el caso del zinc, todas las cepas crecieron bajo las concentraciones de 25 y 50 ppm, y solo la cepa GB51 y la cepa control positivo crecieron en 100 y 200 ppm.

Todas las cepas crecieron en presencia de vanadio (25 ppm) y solo la cepa GB51 creció en 50 ppm. La cepa P. putida KT2440 creció bajo todas las concentraciones evaluadas para vanadio (25, 50, 100 y 200 ppm). Molibdeno y plomo, fueron los únicos metales que no mostraron afectación en el crecimiento de todas las cepas bajo las concentraciones evaluadas (25, 50, 100, 200, 250 y 300 ppm), incluyendo al control positivo.

En la tabla 2 se muestra los resultados que distinguen las diferencias entre las cepas en presencia de metales pesados bajo diferentes concentraciones.

Los resultados del ensayo de resistencia a antibióticos se muestran en la tabla 3, la ampicilina y el cloranfenicol, mostraron algunas coincidencias con lo reportado de las cepas tipo P. aspalathi y P. sediminicola. Fue el caso de todas las concentraciones evaluadas para la ampicilina, con excepción de las cepas GB51 y GB62, en las cuales no se observó crecimiento bajo la concentración de 150 μg/mL. Para el caso del cloranfenicol, solo P. aspalathi ha reportado sensibilidad a este antibiótico y P. sediminicola está reportada por su resistencia a cloranfenicol a la concentración de 5 μg/mL, lo que coincidió con dos cepas evaluadas (GB62 y GB53). Además, se observó crecimiento de las cepas (GB45, GB51, GB152, GB190 y GB203) bajo las concentraciones de cloranfenicol evaluadas, excepto en 20 μg/mL. La cepa P. putida KT2440 utilizada como control positivo creció bajo todas las concentraciones de ampicilina y cloranfenicol evaluadas. De las siete cepas evaluadas, únicamente la cepa GB190 creció bajo la concentración de gentamicina más baja (1 μg/mL) y en la cepa control positivo se observó crecimiento en 1 y 2.5 μg/mL. La tetraciclina fue el único antibiótico en el cual no se registró crecimiento para las siete cepas evaluadas bajo ninguna concentración, y solo el control positivo creció en la concentración más baja (2.5 μg/mL). La cepa GB190 fue la única cepa que creció bajo la concentración de 1 y 2.5 μg/mL de kanamicina. El control positivo solo creció en la concentración más baja de este antibiótico (1 μg/mL). Según la literatura, las cepas tipo, P. sediminicola y P. aspalathi, son sensibles a la presencia de gentamicina, tetraciclina y kanamicina [21, 22].

Caracterización genotípica

La identificaciónn genotípica de las siete cepas se verificó mediante la amplificación de los genes de mantenimiento: recA y atpD utilizando a la cepa control Paraburkholderia unamae MTl-641, y la secuenciación. Los amplicones obtenidos y visualizados de 704 pb para el gen recA y 756 pb para el gen atpD se identificaron como Burkholderia spp. que coincide con lo establecido por Spilker et al. [24]. Al comparar por BLAST las secuencias del ARNr 16S (~1380 pb) de las siete cepas con la base de datos de nucleótidos de NCBI mostraron que se agrupaban con las especies del género Paraburkholderia, por ejemplo, las secuencias del ARNr 16S de las cepas GB45, GB53, GB62, GB152 y GB203 compartieron entre el 100 y el 99.78 de identidad con P. sediminicola, y en menor porcentaje con otras especies descritas del género como es P. aspalathi. En cuanto a GB51 mostró identidad del 99.55% con B. phytofirmans y con P. caledonica el 99.35%, así mismo, la cepa GB190 se alineó con otros siete aislados identificados como Paraburkholderia sp. en el GenBank (NCBI), como es el caso de la cepa PA-G9 y PA-C10 con un porcentaje de identidad del 99.50% y 99.21%, respectivamente. En todos los casos el valor de expectancia E (E-value) fue de 0.0.

Construcción y análisis de los árboles filogenéticos

Cervantes-Álvarez (2016) [20], evidenció un bajo poder de discriminación cuando se genera una filogenia a partir del gen marcador ARNr 16S, el cual es sumamente conservado en el grupo Burkholderia (s.l), con los siete aislamientos de este estudio, debido a la cercanía genética unos de otros obteniendo un árbol filogenético poco resuelto. Sin embargo, al construir el árbol filogenético con las secuencias de los genes recA y atpD (material suplementario), así como también con las secuencias concatenadas parciales de los tres genes de mantenimiento; ARNr 16S, recA y atpD (2135 pb), se observa que las cepas GB45, GB53, GB62, GB152 y GB203 e incluso GB51, se posicionaron muy cerca de P. aspalathi VG1C y P. sediminicola HU2-65W. En cuanto a la cepa GB190 se observó fuera de este clúster aún, con un bootstrap del 98% (Fig. 2).

Para especificar solo las relaciones entre los taxones y GB190 se construyó un árbol mediante Neighbor-Joining sin enraizar, observando que esta cepa se mantiene separada de las dos especies de Paraburkholderia (Figura 3).

DISCUSIÓN

La morfología colonial que exhibieron las siete cepas en medios PCAT y LB coincide con lo reportado para Paraburkholderia sediminicola y Paraburkholderia aspalathi [21, 22]. No obstante, GB190 además de presentar las tres características morfológicas (blanca, cremosa y puntiforme), mostró un halo transparente alrededor de la colonia lo que la distingue del resto. De igual modo, para el ensayo de temperatura, en particular a 39 °C, después de 96 h de incubación, la cepa GB190 no creció a diferencia del resto de las cepas que presentaron ligero crecimiento. La temperatura para un crecimiento óptimo en todas las cepas fue a 35 °C, el cual se observó después de 48 horas. Comparado estos resultados con P. sediminicola el rango de temperatura para el crecimiento es de 15-30 °C; no presenta crecimiento a 42 °C [22]. Mientras que la temperatura para un crecimiento óptimo en P. aspalathi es de 20-30 °C, sin embargo, se reporta un crecimiento moderado a 37 °C y sin crecimiento a 45 °C [21]. Como resultado de este estudio, se observó un crecimiento óptimo a una temperatura de 35 °C después de 48 h de incubación, considerando que esta temperatura está dentro del rango de temperaturas propia que caracterizan a bacterias mesófilas en el suelo (30-39 °C) [29]. Además, se observó que entre más alta la temperatura, los aislados tardaban más en crecer, infiriendo que las bacterias quizás pueden sobrevivir, pero por un tiempo determinado no hay división celular sino hasta después de su adaptación, conllevando a una recuperación y comenzando de nuevo la división. Como en el caso de B. pseudomallei las temperaturas altas inducen cambios en las enzimas metabólicas, chaperonas, proteínas de movilidad celular, antioxidantes y proteínas estructurales ocasionando cambios en las fases de crecimiento [30]. Razones por las cuales, la temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la proliferación y mantenimiento de la viabilidad de los microorganismos.

En cuanto al ensayo de NaCl al 1% sólo se observó crecimiento moderado de las cepas GB45, GB53, GB62, GB152 y GB203 después de las 48 horas, pero no en GB51 y GB190. A una concentración al 2% se tiene que sólo GB62 y GB203 presentaron un ligero crecimiento, a partir de una concentración al 3% ya no hay proliferación celular de ninguna de las siete cepas. Por lo tanto, mostraron cierta sensibilidad en presencia de cloruro de sodio, dependiendo la cepa, y el mejor crecimiento se obtiene sin NaCl en todas las cepas. Comparando con otras especies, se reporta que en P. sediminicola es posible el crecimiento en presencia de NaCl al 1.5% incubada a 28°C [22], para P. aspalathi en una concentración del 1% al 10% [21], P. sartisoli crece a una concentración de 0.5% [14], sin embargo, el crecimiento óptimo es en ausencia de NaCl para estas tres especies, así como para las siete cepas estudiadas. Otra característica importante para estudiar el crecimiento de bacterias en presencia de NaCl es la búsqueda de genotipos bacterianos tolerantes a la salinidad para solucionar los problemas que ocurren con la fijación biológica de nitrógeno [31] demostrando que altas concentraciones de NaCl, por encima de 10g/L, influyen negativamente en el crecimiento bacteriano de Burkholderia gladioli y Paraburkholderia heleia asociadas a plantas de caña de azúcar cultivadas en Pernambuco, Brasil; a pesar de que B. gladioli presentó más tolerancia a la salinidad que P. heleia. Como un efecto indirecto, Pereira y colaboradores, observaron que altas concentraciones de NaCl (> 25 g/L) influye negativamente en la producción del ácido indol acético in vitro e inhibe la capacidad de fijar nitrógeno in vitro tanto para B. gladioli y de P. heleia.

El pH es también un factor muy importante en el metabolismo y la reproducción de las bacterias, ya que la variación en éste puede llegar a inactivar el sistema metabólico y destruir a la bacteria. En el ensayo de pH 4 sólo no se observó crecimiento de dos cepas: GB53 y GB190. En pH 8 crecen todas las cepas pero el crecimiento óptimo se registró en un pH 6. Las siete cepas utilizadas en este estudio se aislaron en un rango de pH (5.2−5.8). Con respecto a P. sediminicola se ha publicado que las células crecen en un rango de pH 6.0−8.0 y en el caso de P. aspalathi se reporta crecimiento en un rango de pH 4−8 a 28 °C. Pero, en ambos casos se obtiene un crecimiento óptimo a pH 6 y 7. Existen reportes de aislamientos de Paraburkholderia a partir de rizósfera con pH ácido, tales como P. tropica, especie aislada en el rango de pH 4.5 a 6.5 [10] y P. unamae, la cual fue aislada de la rizósfera en un rango de pH de 4.5−7 [18]. P. acidipaludis y P. heleia fueron aisladas a partir de la planta Eleocharis dulcis, la cual crece en pantanos altamente ácidos (pH 2−4) [15]. Por ende, es posible que un determinado rango de pH favorezca el establecimiento de ciertas especies pertenecientes al género.

Se conoce que la base de agar sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difícil crecimiento y posibles bacterias que podrían afectar la salud humana, y en este caso se utilizó como una prueba indirecta para vislumbrar la posibilidad de que los aislados fueran agentes patógenos en mamíferos o humanos. Al añadir sangre, puede usarse para mostrar la actividad hemolítica debido a que los microorganismos hemolíticos liberan enzimas (hemolisinas) al medio que destruyen los glóbulos rojos apareciendo halos de hemólisis. Sin embargo, se observó ausencia de lisis de los glóbulos rojos ya que el medio no presentó modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio. En el género Burkholderia sensu stricto algunas cepas han mostrado actividad hemolítica, aun siendo aisladas del ambiente y con potencial biotecnológico. A la fecha, ha sido claro que el linaje Paraburkholderia no contiene cepas patógenas, estudios de análisis de genómica comparativa han validado su potencial no patogénico, lo cual establece la posibilidad de su uso como promotoras de crecimiento en plantas, manejo de enfermedades y otras aplicaciones biotecnológicas [32].

Por otra parte, en la prueba de metales se observó que en níquel, cobalto, molibdeno y plomo hay crecimiento de las siete cepas hasta una concentración de 250, 50, 300 y 300 ppm, respectivamente. Mientras tanto, en zinc y en vanadio sólo GB51 fue capaz de crecer después de dos días en una concentración de 200 y 50 ppm, correspondientemente. Los resultados mostraron que estas cepas bacterianas pueden estar bajo concentraciones elevadas de diversos metales pesados, y esto podría deberse a las diferencias en la estructura de su pared celular o variaciones en sus mecanismos de resistencia. A pesar de que a la fecha no existen evidencias experimentales de la tolerancia a metales pesados de las cepas. P. sediminicula y P. aspalathi, existen diversos reportes sobre Burkholderia (s.l) capaces de crecer en presencia de metales pesados, como Burkholderia sp. J62 la cual fue la mejor solubilizando el plomo y el cadmio en cultivo en disolución [33]. Otras especies que son capaces de inmovilizar metales pesados y reducir su translocación en las plantas mediante precipitación, formación de complejos y adsorción, promueven el crecimiento en plantas. Por ejemplo, Burkholderia gladioli en la mitigación del estrés por cadmio en Lycopersicon esculentum [34] y Burkholderia cepacia CS2-1 que mejoró el crecimiento en Brassica rapa al disminuir la absorción de Zn+ indicando que es adecuada para la biorremediación [35]. Existen diversos mecanismos en las bacterias a través de los cuales un sistema puede conferir resistencia a metales pesados; algunos están codificados en plásmidos y tienden a ser específicos para un metal en particular. También se ha observado la producción de sustancias poliméricas extracelulares que se unen fuertemente a los metales. Los exopolímeros microbianos, los cuales están compuestos de residuos de azúcares que son secretados al medio circundante, son particularmente eficientes en la unión de metales pesados, como plomo, cadmio y uranio, coadyuvando en la absorción de metales pesados para células bacterianas en ambientes naturales [36]. En el caso particular de Burkholderia cepacia GYP1, la cual se aisló de suelos agrícolas contaminados con metales pesados, Zhang y colaboradores evidenciaron que esta cepa bajo condiciones oligotróficas, es decir, un ambiente en donde existen bajas concentraciones de fuentes de carbono, fosfatos, nitratos y hierro, tuvo una alta capacidad de acumulación de cadmio de hasta 116 mg/g de biomasa (peso seco) al producir estas sustancias poliméricas extracelulares [37].

Por otro lado, este estudio reveló que las siete cepas no mostraron sensibilidad hacia dos antibióticos, ampicilina y cloranfenicol, y ninguna de ellas creció en presencia de tetraciclina. Solo GB190 fue capaz de crecer en kanamicina (1 y 2.5 μg/ml) y gentamicina (1 μg/ml), diferencias que podrían ser aprovechadas para ser utilizadas como marcador para evaluar su supervivencia en experimentación posterior, si fuera el caso. Hasta el momento se cree que la primera línea de defensa contra los antimicrobianos en las especies de Burkholderia es la barrera de penetración de la membrana externa impermeable y por las proteínas efluentes eficientes [38], no obstante, existen diversos estudios que han reportado la sensibilidad a aminoglicósidos, como son la gentamicina, kanamicina, en cepas pertenecientes al género Paraburkholderia [39, 40, 41].

Entre los marcadores moleculares, los genes constitutivos recA y atpD, han sido ampliamente adoptados en estudios filogenéticos y taxonómicos dentro del grupo Burkholderia (s.l), incluido la reclasificación reciente de las especies ambientales de Paraburkholderia [8, 42]. En este estudio, las topologías de los árboles filogenéticos obtenidos, por una parte, muestran la estrecha relación de cinco de las siete cepas utilizadas en este estudio con P. sediminicola y P. aspalathi, y, además, que la cepa GB190 en ambas topologías, se distingue claramente fuera de este grupo, representando un linaje separado, sugiriendo que representa una nueva especie. De igual modo, se evidenció una similar posición taxonómica de la cepa GB190 cuando se realizó la filogenia a partir de los genes de mantenimiento por separado (Material suplementario).

CONCLUSIONES

Los aislados utilizados en este estudio presentaron una morfología colonial muy similar, caracterizándose por ser de color blanco y cremoso como el género Paraburkholderia, a excepción del aislado GB190 que mostró en su fenotipo un halo transparente alrededor de la colonia blanca y cremosa en medio PCAT. Todas las cepas crecieron a 35 °C y a un pH 6 y mostraron sensibilidad en presencia de NaCl, incluso al 1% como fue el caso para las cepas GB51 y GB190. Al evaluarse la actividad hemolítica, todas las cepas mostraron hemólisis tipo gamma, es decir, ninguna fue capaz de realizar hemólisis ya que no hubo halo alrededor de la colonia. De las cinco fuentes de carbono; solo el citrato fue utilizado por las siete cepas. GB51 toleró concentraciones de 200 ppm de zinc y 50 ppm de vanadio. La cepa GB190 presentó ciertas diferencias con las demás cepas, por ejemplo; a pesar de ser aislada del mismo pino como GB203 no creció a una temperatura de 39 °C y a un pH 4, pero fue la única cepa que creció en gentamicina (1 μg/mL) y kanamicina (2.5μg/mL). La amplificación de los genes atpD y recA sirvieron como base para elucidar las relaciones filogenéticas entre las cepas y las especies de Paraburkholderia. Las características fenotípicas y genotípicas permitieron distinguir a GB190 como posible nueva especie perteneciente al género Paraburkholderia. Las cepas GB45, GB51, GB53 GB62 y GB152 se identifican como Paraburkholderia sediminicola, y GB203 como Parburkholderia aspalathi.

CONFLICTO DE INTERESES

Se declara que no existe un conflicto de intereses por parte de los autores.

AGRADECIMIENTOS

La cepa Pseudomonas putida KT2440 fue proporcionada amablemente por el grupo “Ecology and Survival of Microorganisms”, Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana (CICM-ICUAP).

Se agradece el apoyo brindado por la Dra. Guadalupe Rocha-Bonilla en la instrucción bioinformática.

Los autores también agradecen a la VIEP-BUAP por el apoyo para realizar este trabajo. Así mismo, la primera autora agradece el apoyo y la participación en el programa “Jóvenes Investigadores”.

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