Rumbo a la generación de inoculantes en polvo a base de Pseudomonas putida KT2440

Elizabeth Alonso-Torres¹ iD, Yesmin Panecatl Bernal² iD, José Joaquín Alvarado-Pulido² iD, Luis Ernesto Fuentes-Ramírez³ iD, Javier Martínez-Morales⁴ iD, Jesús Muñoz-Rojas¹* iD, Yolanda Elizabeth Morales-García^1,5** iD

¹Grupo “Ecology and Survival of Microorganisms”, Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. ²Centro de Investigación en Dispositivos Semiconductores, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. ³Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. ⁴Laboratorio de Fisiología Microbiana de la Interacción Microorganismo-Hospedero, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. ⁵Facultad de Ciencias Biológicas, Licenciatura en Biotecnología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, México. *joymerre@yahoo.com.mx; **yolanda.moralesg@correo.buap.mx

http://doi.org/10.5281/zenodo.7099040

Bajar cita (RIS): Alonso-Torres et al., 2022 AyTBUAP 7(27):87-116

Editado por: Verónica Quintero-Hernández (Profesora Investigadora de Cátedras CONACYT-Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla)

Fecha de publicación: 27 septiembre 2022

EOI: https://eoi.citefactor.org/10.11235/BUAP.07.27.03

URI: https://hdl.handle.net/20.500.12371/16412

Referencia: Alonso Torres E, Panecatl Bernal Y, Alvarado-Pulido JJ, Fuentes-Ramírez LE, Martínez-Morales J, Muñoz-Rojas J, et al. Rumbo a la generación de inoculantes en polvo a base de Pseudomonas putida KT2440. Alianzas y Tendencias BUAP [Internet]. 2022;7(27):87–116. Available from: https://www.aytbuap.mx/aytbuap-727/rumbo-a-la-generación-de-inoculantes-en-polvo-a-base-de-pseudomonas-putida

RESUMEN

La adición de fertilizantes nitrogenados, pesticidas y herbicidas en los cultivos agrícolas, ha traído enormes consecuencias para el ambiente y la salud de los organismos terrestres. Las bacterias promotoras del crecimiento de plantas podrían ser una alternativa para evitar el uso de esos productos sin arriesgar o disminuir los rendimientos de los cultivos. Pseudomonas putida KT2440 es una bacteria capaz de biodegradar compuestos orgánicos y también de promover el crecimiento de plantas; especialmente bajo condiciones de estrés ambiental. Por esta razón, esta bacteria ha sido seleccionada para el diseño de inoculantes de segunda generación. Los inoculantes de segunda generación en la actualidad están en formulaciones líquidas que requieren de refrigeración para mantenerlas estables. Es deseable contar con formulaciones que no requieran energía para su almacenamiento y transporte, por lo que las formulaciones en polvo serían las más apropiadas para mantener la estabilidad hasta su aplicación a un bajo costo. Para conseguir esto se requieren estudios de la tolerancia a la desecación de las bacterias de interés y conocer cómo podemos potenciar la supervivencia de las bacterias benéficas bajo condiciones de estrés por disminución de la actividad de agua. En este trabajo se ha revisado el panorama general del conocimiento que se tiene sobre la supervivencia de P. putida KT2440 a la desecación ambiental y la desecación por liofilización, la ayuda por protectores, la función de la membrana bacteriana, así como algunos genes clave que podrían estar implicados en la tolerancia a la desecación de esta bacteria.

Palabras clave: Pseudomonas putida KT2440; inoculantes bacterianos; desecación; liofilización; supervivencia bacteriana.

ABSTRACT

The addition of nitrogen fertilizers, pesticides and herbicides in agricultural crops has brought enormous consequences for the environment and the health of terrestrial organisms. Plant growth-promoting bacteria could be an alternative to avoid the use of these products without risking or reducing crop yields. Pseudomonas putida KT2440 is a bacterium capable to biodegrade organic compounds and also able to promote plant growth; especially under conditions of environmental stress. For this reason, this bacterium has been selected for the design of “second generation” inoculants. The latter require refrigeration to keep them stable. It is desirable to have formulations that do not require energy for storage and transport, therefore powder formulations would be the most appropriate to maintain stability until application at low cost. To achieve this, studies of the tolerance to desiccation of the bacteria of interest are required, so we need to know how to enhance the survival of beneficial bacteria under stress conditions. In this work, the general knowledge on the survival of P. putida KT2440 against environmental desiccation and lyophilization has been reviewed. Aspects, such as the increased survival by protecting compounds, the function of the bacterial membrane, as well as some key genes that could be involved in the tolerance to desiccation of this bacterium, were also covered.

Keywords: Pseudomonas putida KT2440; bacterial inoculants; desiccation; freeze drying; bacterial survival.

INTRODUCCIÓN

Para aumentar la producción agrícola se han utilizado grandes cantidades de fertilizantes químicos, herbicidas, pesticidas entre otros compuestos tóxicos [1]. Este es un problema de dimensiones mundiales y en múltiples ocasiones se ha reportado [1]. México al igual que otros países del mundo ha adoptado estas prácticas y a continuación mostramos su panorama. De acuerdo con la FAO en el periodo de 2002 a 2011, la cantidad promedio de fertilizante nitrogenado adicionada en cultivos agrícolas de México fue de 893165.572 toneladas (t) para urea, 163647.711 t para fertilizantes tipo NPK, 8166.8733 t para el caso de nitrato de potasio y 134487.2 t para el nitrato de amonio (Tabla 1). La base de datos no cuenta con información más actualizada, sin embargo, es altamente probable que el uso de estos insumos continúa siendo adicionado en forma intensiva. La adición de estos compuestos ha desequilibrado al medio ambiente y contaminado los suelos agrícolas [2]. Dentro de los problemas más ampliamente documentados está la eutrofización, la alta generación de compuestos NOx que al reaccionar con el agua de las nubes producen lluvia ácida y en el peor de los casos, si esos compuestos de tipo NOx llegan hasta la estratósfera, reaccionan con el ozono, debilitando la capa y siendo responsables en gran parte del cambio climático que en la actualidad se está viviendo [1, 2]. Por otro lado, es ampliamente conocido que la adición de pesticidas y herbicidas también ha provocado un efecto nocivo sobre el medio ambiente y los seres vivos [3–5]. Muchos de estos compuestos incluso son carcinogénicos y afectan gravemente a la salud humana [6–9].

Una alternativa para reducir la aplicación de estos compuestos recalcitrantes sin una disminución del rendimiento, es utilizar bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB; por sus siglas en inglés), estas bacterias interactúan con las plantas, promueven su crecimiento y algunas cepas tienen la capacidad de biorremediar compuestos tóxicos para el medio ambiente y el humano [10–13].

Las PGPB e inoculantes para la agricultura

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal incluyen diversos géneros y de forma natural colonizan en la rizósfera, nódulos radiculares, región aérea, entre otras estructuras de las plantas [14–17]. Estas bacterias resultan ser beneficiosas gracias a los mecanismos que ayudan en la salud y crecimiento de las plantas [18, 19]. Los mecanismos implicados en la promoción del crecimiento vegetal se clasifican en directos e indirectos. En los mecanismos directos las bacterias permiten una mejor nutrición para las plantas, algunos ejemplos son la fijación biológica de nitrógeno, la producción de fitohormonas, la solubilización de fosfatos y la solubilización de zinc. Por otro lado, los mecanismos indirectos están involucrados en la protección de las plantas contra patógenos en donde encontramos; el biocontrol, la resistencia sistémica inducida (ISR; por sus siglas en inglés), la resistencia sistémica adquirida (SAR; por sus siglas en inglés) y la producción de compuestos volátiles implicados en desencadenar respuesta de defensa en las plantas [18].

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal reducen la concentración de compuestos recalcitrantes y a su vez promueven el crecimiento de la planta [20–22]. Por esta razón, este tipo de bacterias podrían ser incorporadas como inoculantes bacterianos destinados a potenciar el rendimiento de cultivos agrícolas y a su vez, realizar la biorremediación de suelos contaminados por compuestos recalcitrantes adicionados en la forma de pesticidas herbicidas e incluso antibióticos [12, 19, 23].

En distintos países del mundo se han aprovechado los beneficios de las PGPB para formular inoculantes bacterianos conteniendo bacterias PGPB, estos han resultado amigables con el medio ambiente y estimulan el crecimiento de los cultivos agrícolas [24]. Uno de los principales países en donde se comercializan distintos tipos de formulaciones es la India [25, 26]. En México aún falta más información sobre la utilidad, diseño, beneficios que tienen los inoculantes en la agricultura y su aplicación aún no está tan diseminada, sin embargo, algunos esfuerzos recientes han iniciado con el fin de informar a los agricultores sobre los beneficios y ya existe un mercado creciente de este tipo de formulaciones [27].

En la actualidad, muchas de las formulaciones disponibles en el mercado mexicano solo contienen un microrganismo; en los que destacan formulaciones hechas a base de Azospirillum sp. ó Rhizobium sp. [19]. Sin embargo, recientemente se han diseñado inoculantes, en donde se incorporan a más de una cepa bacteriana, todas con características PGPB, pretendiendo obtener un mayor beneficio en el crecimiento de la planta mediante un efecto de sinergismo [19, 27]. Existen pocos estudios acerca de cómo ocurre el sinergismo entre varias cepas microbianas, o como ocurre la expresión de genes bajo co-interacción con las plantas, por lo que estos temas representan un reto para ser abordados en un futuro cercano [12]. Para obtener un inoculante con bacterias de tipo PGPB se requieren de distintos estudios como son adhesión bacteriana, colonización de raíces, demostrar que las cepas tengan la capacidad de promover el crecimiento de las plantas e incluso que tengan capacidades adicionales como un efecto de biocontrol contra patógenos o biorremediador de compuestos xenobióticos [28]. Es importante mencionar que se requiere realizar estudios de supervivencia de las bacterias bajo condiciones de estrés para seleccionar las más aptas a los diferentes escenarios donde serán aplicadas [23] y en el caso de inoculantes con más de una especie bacteriana se requieren también estudios de antagonismo para asegurar que las cepas son compatibles [26].

Inoculantes monoespecie vs inoculantes con más de una cepa microbiana

Sin duda los inoculantes con una sola cepa microbiana han sido el punto de partida para comprender como podemos obtener beneficios de la interacción microorganismo-planta. Sin embargo, los inoculantes monoespecie no siempre son capaces de promover el crecimiento de las plantas y en muchas ocasiones fallan para lograrlo [18]; esto podría depender del tipo de especie, la variedad de la planta, las condiciones climatológicas, el tipo de suelos, entre otros factores. Se ha reportado que los inoculantes tienen mayor eficacia cuando existe más de una bacteria benéfica. Entre los años 2010 a 2020 se han publicado estudios que demuestran que la coinoculación de dos o más cepas es mejor que la mono-inoculación [29, 30]. Por ejemplo, existe un excelente sinergismo entre Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y el agente de biocontrol Bacillus sp. CHEP5, donde la inoculación de ambas cepas incrementan el peso seco de nódulos, así como el porcentaje de nitrógeno de Arachis hypogaea L. (maní), además aumenta la defensa contra patógenos [31]. Por otro lado, las rizobacterias Bacillus subtilis 189 y Pseudomonas fluorescens RB4 fueron coinoculadas para intensificar la absorción y la fitorremediación en Catharanthus roseus en suelos contaminados con metales, obteniendo una mayor captación de nutrientes, mejora la absorción de metales y hay un aumento de biomasa [32]. Methylobacterium oryzae CBMB20 con Azospirillum brasilense CW903 ó Burkholderia pyrrocinia CBPB-HOD coinoculadas en diferentes tipos de plantas incrementaron la longitud de los brotes, la absorción de nutrientes y el aumento de ciertas enzimas [33]. La coinoculacion de cepas Pseudomonas fluorescentes y Rhizobium mejoraron el crecimiento de plantas, además de aumentar la actividad antifúngica contra patógenos [34]. Mesorhizobium ciceri en conjunto con rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR; por sus siglas en inglés) con actividad ACC-desaminasa (Serratia marcescens (SF3) y Serratia sp. (ST9), aumentaron el rendimiento del fruto y el contenido de clorofila en cultivos de Cicer arietinum (Garbanzo) [35].

Recientemente se han diseñado inoculantes multiespecies en donde se incorporan a más de una cepa bacteriana principalmente de características PGPB y existe sinergismo entre ellas [19, 36, 37]. Estas formulaciones están resultando muy útiles para estimular el crecimiento de plantas a pesar de las variaciones en las condiciones ambientales y se han denominado inoculantes de segunda generación [12, 27, 36, 38]. Para el diseño y desarrollo de inoculantes de segunda generación se deben de realizar estudios adicionales a los realizados para el diseño de inoculantes que contienen una sola especie, para así garantizar la eficacia en referencia a los monoinoculantes [27]. Se debe asegurar compatibilidad entre cepas, se hacen estudios para explorar la tolerancia de las cepas a condiciones de estrés como la desecación y se demuestra su efectividad en conjunto para la promoción de crecimiento de plantas. Para estos estudios se debe de contar con medios de cultivo de selección de cada cepa que forma parte de una mezcla bacteriana, así como métodos moleculares para la corroboración de la cepa estudiada cuando se encuentra cointeraccionando con las otras especies bacterianas [26, 27, 36]. En la actualidad las formulaciones de segunda generación se comercializan en presentaciones líquidas y se requiere refrigeración para su resguardo, por lo que los costos de almacenamiento y transporte incrementan los costos del producto final [27]. Será deseable contar con formulaciones en polvo estables que eviten ese gasto energético, para ello se requiere realizar estudios de desecación de las bacterias de interés y saber cómo podemos incrementar su supervivencia ante la limitación de agua.

La supervivencia microbiana y efectividad de los inoculantes

La supervivencia de los microorganismos es clave para el éxito de los inoculantes bacterianos. Comúnmente los inoculantes bacterianos contienen un acarreador para proteger a las células bacterianas de interés de las adversidades que sufren desde su producción hasta su aplicación en el campo [39–41]. Otro aspecto es que los microorganismos deben de mantenerse en una cierta concentración, comúnmente por arriba de un millón de bacterias por gramo de suelo para mantener la efectividad [42]. Sin embargo, durante el almacenamiento las bacterias sufren una disminución en el número de células en función del tipo de acarreador y las condiciones de temperatura [43]. Para el caso de formulaciones en turba y en polvo, esta disminución podría ser debida a la baja disponibilidad de agua [44, 45]. Por otro lado, después de la inoculación de semillas con bacterias de tipo PGPB, se puede ocasionar un nuevo descenso en el número de bacterias si ocurre un estrés hídrico en el suelo [23, 46, 47]. La escasez de agua en los campos agrícolas en ciertos periodos del año, son eventos cada vez más frecuentes y afectan fuertemente a los cultivos [48, 49]. Los eventos de disminución o incremento de lluvias han sido relacionados con el cambio climático [50]. Esto ha traído como consecuencia que los cultivos de temporada se vean afectados por la escasez de precipitaciones o por exceso de ellas [49, 51]. En el caso de semillas inoculadas, es importante que los microorganismos que integran a un inoculante deben tener la capacidad para adaptarse a las diferentes condiciones donde son cultivadas [23, 46], como son salinidad, eventos de sequía, la fisiología de la planta, asimismo deberán tener sinergia con el tipo de cultivo donde serán utilizados y la formulación que contiene estos microorganismos deberá ser de fácil aplicación [39, 40].

Importancia de la desecación en bacterias benéficas

El agua es fundamental para el desarrollo de cualquier ser vivo y la desecación afecta fuertemente a la supervivencia [52, 53]. La desecación es la perdida de agua de las células hasta el equilibrio con el agua presente en el entorno, una desecación extrema ocurre a 30 °C y 50% de Humedad Relativa (HR) [23, 36]; condición en la cual se pierde agua hasta alcanzar 0.1 g de agua por gramo de masa seca [54]. Durante la desecación el metabolismo celular disminuye hasta que se detiene [55] y solo las células de organismos anhidrobiontes recuperan sus funciones fisiológicas tras la rehidratación [23, 54].

Durante la desecación las bacterias PGPB sensibles disminuyen su viabilidad, debido entre otras cosas a la acumulación de sales, provocando estrés osmótico, hay daño a nivel de membrana, ADN, proteínas, entre otros [55–58]. Las células desecadas que no son tolerantes no podrán ejercer sus funciones benéficas tras la rehidratación [23]. Elaborar formulaciones estables y eficaces que sobrepasen las distintas condiciones adversas como la baja disponibilidad de agua ha sido un reto de los últimos años [23, 36]. Sin embargo, pocas formulaciones de inoculantes que contienen bacterias tolerantes a la desecación han sido desarrollados [36, 59].

Ensayos para estudiar la tolerancia a la desecación en bacterias

Para comprender la tolerancia a la desecación de bacterias tipo PGPR, se han llevado a cabo estudios bajo condiciones extremas donde se provoca la pérdida de agua [23, 55, 60]. Dos tipos de ensayos se destacan para estudiar la tolerancia de las bacterias a la desecación: 1) ensayos de desecación ambiental controlada y 2) ensayos de desecación por liofilización [23, 61]. En ambos experimentos las células bacterianas son centrifugadas tras su crecimiento y el sedimento celular es resuspendido en agua o en una solución protectora, las muestras se pueden dispensar en tubos eppendorf de 1.5 µL con 500 µL de volumen inicial y cada tubo es cubierto por un tapón de algodón que permite la evaporación de agua. A continuación, se describen las condiciones de ambos métodos y sus alcances.

Condiciones de desecación ambiental y niveles de tolerancia

Las condiciones de desecación ambiental controlada comúnmente ocurren a 30 °C y 50% de humedad relativa a una presión de aproximadamente 1 atmósfera [23, 62]. Las cuantificaciones del número de bacterias se realizan antes de la desecación y comúnmente cada 3 días posteriores al inicio de la desecación (DPID) hasta los 18 DPID. Las muestras alcanzan su máxima pérdida de agua entre el quinto y sexto día después del inicio de la desecación (Figura 1). Este método de desecación se ha utilizado principalmente para conocer la capacidad de tolerancia a la desecación de bacterias benéficas, por lo que los resultados pueden identificar a las más tolerantes bajo condiciones muy similares a las condiciones que sufrirán en los campos agrícolas [23]. Sin embargo, son estudios que requieren de una inversión alta de tiempo. Para una comparación rápida entre el número de bacterias que sobrevive después de la desecación con relación al número de bacterias iniciales (antes de la desecación) se ha propuesto un concepto denominado tasa de supervivencia bacteriana (BSR de sus siglas en inglés “Bacterial Survival Ratio”) [36, 60, 61, 63]. La BSR se define como la relación del número Log de bacterias después de la desecación (log PD) más 1 entre el número Log de bacterias antes de la desecación (log BD), cuyo resultado se multiplica por 100; BSR = [(logPD + 1)/logBD] × 100 [62].

En función de la tolerancia a la desecación ambiental, se han propuesto 5 niveles de supervivencia bacteriana, los cuales se han designado por colores para una visualización rápida (Figura 2): bacterias altamente tolerantes (BSRad˃80) (azul), bacterias tolerantes (60 <BSRad≤80) (verde), bacterias de mediana tolerancia (40 <BSRad≤60) (amarillo limón), bacterias de tolerancia baja (20 <BSRad≤40) (amarillo oscuro) y bacterias de muy baja tolerancia a la desecación (BSRad≤20) (rojo) [23]. Las bacterias altamente tolerantes a la desecación son adecuadas para desarrollar formulaciones estables que puedan adaptarse y tolerar la perdida de agua. Además, se podrían diseñar formulaciones en polvo debido a su fácil manejo y transporte al campo. Al momento de rehidratar a las células, sus características podrán aprovechar sus beneficios en el sitio agrícola de aplicación.

Entre las bacterias altamente tolerantes a la desecación en aire destacan Azospirillum halopreferans, Burkholderia unamae MTl-641, Burkholderia tropica MTo-293 y Enterobacter sp. UAPS03001 [23, 26].

Desecación por liofilización y la preservación de bacterias

El proceso de liofilización tiene como finalidad la preservación de las muestras, facilita el transporte y reduce el espacio de almacenamiento, sin que se afecten sus características originales. El proceso de liofilización es específico para cada muestra y para obtener óptimos resultados se deben de caracterizar las condiciones y a los protectores adecuados [64, 65]. Es definido como un método estable que deseca la muestra bajo condiciones de vacío [66].

La desecación mediante liofilización se diferencia fuertemente de la que ocurre en la desecación ambiental, ya que 3 formas de estrés están implicadas en el proceso [64, 67, 68]. Primero las muestras son sometidas a congelación, donde la muestra toma una forma de cristal, este paso es crucial para el producto liofilizado. Después, las muestras congeladas se colocan en el liofilizador donde estás sufren un vacío hasta 20 mTorr o menos, una condición que se aproxima al vacío absoluto. Esto implica que las células sufren un descenso de presión de aproximadamente 1 atm. Bajo estas condiciones el agua congelada pasa de un estado sólido-congelado a un estado gaseoso (sublimación), esta etapa se conoce como el secado primario; donde aproximadamente entre el 70 y 90 % de agua se evapora en condiciones de vacío. Posteriormente, el secado secundario o desorción en donde se elimina entre el 5 al 10% de humedad restante en la muestra [66]. Las células de la muestra quedan como polvo y el agua evaporada es capturada en una trampa que se encuentra a -80 °C. Después de aproximadamente 24 horas las muestras con las células desecadas son sacadas del liofilizador, para ello, de forma gradual se rompe el vacío para retornar a 1 atmósfera de presión (760 Torr). Esto implica que para el proceso de liofilización las células sufren congelación, desecación y dos cambios de presión. Las cuantificaciones del del número de bacterias se realizan antes de la liofilización, después de la liofilización y días posteriores a la liofilización, para determinar la supervivencia bacteriana [67, 69, 70].

En la liofilización debido a la deshidratación de las muestras, éstas pueden sufrir daño, por ejemplo, en muestras biológicas las proteínas pueden desnaturalizarse, afectando la supervivencia bacteriana [69], es por ello que se requiere de protectores, que tienen como finalidad proteger a la muestra de los distintos tipos de estrés que las células sufren durante el proceso. Estos protectores pueden ser de diferente naturaleza química por ejemplo polioles, disacáridos, aminoácidos entre otros [70].

La liofilización en el área de microbiología se ha utilizado principalmente para el almacenamiento y preservación a largo plazo de cepas microbianas, lo que permite mantener una alta viabilidad y supervivencia [57, 70]. Este método es útil para el almacenamiento hasta por 50 años de algunas bacterias, sin embargo, las condiciones o protectores dependerán del microorganismo liofilizado [71]. Esta técnica se ha utilizado como una herramienta sencilla y rentable para mejorar y disminuir la contaminación de probióticos o suplementos alimenticios, que tienen como base a bacterias ácido lácticas. En un estudio, Lactobacillus plantarum fue sometida a dos procesos de desecación, la liofilización y secado por aspersión, la liofilización resultó ser más eficiente y permitió una mayor supervivencia y estabilidad bacteriana; siendo los disacáridos no reductores los mejores protectores [72].

El uso de protectores como la trehalosa, la sacarosa y el myo-inositol han sido ampliamente utilizados en el proceso de liofilización bacteriana [61, 64, 70]. Sin embargo, no existe un protector universal y hay aún pocos estudios de la supervivencia de bacterias a este proceso en comparación con la gran diversidad bacteriana descrita [70]. Algunos ejemplos de bacterias estudiadas en este proceso incluyen a Pseudomonas putida KT2440 [61], Escherichia coli [69], Azotobacter vinelandi [60]. Para propósitos de preservación bacteriana, las células liofilizadas son resguardadas al vacío en liófilos para conservarlas por largo tiempo. Una vez que se procede a realizar el rescate celular, los liófilos tienen que ser abiertos, por lo que el vacío se rompe abruptamente, lo que daña fuertemente a las células, especialmente las de microorganismos sensibles al oxígeno; consecuentemente disminuyendo el número de células viables [68]. Para propósitos de preservación esto no tiene mayor importancia, ya que, con ese número bajo de células viables, se puede reiniciar su crecimiento y rescate. Sin embargo, para formulaciones que contienen microorganismos destinados para la agricultura, un número bajo de células viables puede conducir a una baja eficacia de los inoculantes [42]. No obstante, la liofilización representa una forma rápida de obtener células bacterianas en polvo y podría significar una forma importante para el diseño de formulaciones microbianas en polvo que podrían ser aplicadas en los campos agrícolas después de que las células sean hidratadas en el sitio donde serán aplicadas. Por esta razón, se siguen realizando investigaciones con el fin de conocer cómo se puede aumentar la supervivencia de las células a este proceso [73–75].

P. putida KT2440, una bacteria con varias potencialidades

P. putida KT2440 proviene de la cepa PWWO [36, 76]. A diferencia de la cepa PWWO la cepa KT2440 no contiene el plásmido TOL el cual es responsable de la degradación de tolueno [77]. Sin embargo, la cepa KT2440 mantiene la capacidad de degradar compuestos recalcitrantes como el ácido nicotínico y los ácidos nafténicos, además de usar como fuente de carbono a compuestos aromáticos y se adhiere eficazmente a superficies abióticas y bióticas [78]. P. putida KT2440 es una bacteria Gram-negativa, es saprofita, debido versatilidad y adaptabilidad metabólica puede sobrevivir en distintos ambientes, utilizando diferentes sustratos [79]. Está bacteria está certificada como una cepa biosegura para clonación de genes externos, la secuencia de su genoma tiene una longitud de 6181863 pb [76, 80, 81]. Asimismo, posee un potencial para uso en la biorremediación, biocatalisis, como agente de biocontrol y producción de bioplásticos [81, 82]. P. putida KT2440 es excelente colonizador de la rizósfera de distintas plantas de cultivo, además promueve su crecimiento y salud [36, 81, 83]. Esta cepa es capaz de desencadenar una respuesta de defensa en plantas ejerciendo una protección contra microorganismos patógenos [84, 85]. Interesantemente, la bacteria promueve el crecimiento de las plantas en condiciones adversas de salinidad y de elevadas temperaturas [83]. Lo que ha permitido que esta bacteria sea útil en la generación de inoculantes multiespecies de segunda generación por su compatibilidad con otras cepas y su capacidad de generar efectos benéficos en consorcio [26, 36, 59, 86].

A pesar de sus características benéficas P. putida KT2440 presenta dificultades para tolerar procesos de desecación, tanto bajo condiciones de liofilización [61, 87], como en condiciones de desecación ambiental [23, 62]. Esto significa que si ocurre una sequía en alguna fase previa a la colonización; por ejemplo durante el almacenamiento del inoculante, o después de la aplicación en semillas, la supervivencia de la bacteria declina, siendo esto una limitante para ejercer sus beneficios [61, 87]. Las razones de esta aparente sensibilidad es multifactorial, por ejemplo, ocurren cambios mecánicos, estructurales y metabólicos debido a la disminución de agua y que afectan de forma severa a la integridad de la membrana, ADN y proteínas [47]. Bajo condiciones de desecación, las bacterias sobrevivientes responden al estrés, aumentando la producción de polisacáridos, cambiando la composición de las membranas, incrementando la estabilidad de proteínas, disminuyendo el estrés oxidativo y reparando el ADN dañado [47, 58, 61, 88]. Sin embargo, el conocimiento respecto a la respuesta de P. putida KT2440 aún es mínimo cuando esta bacteria es desecada [62, 88]. Es importante destacar que la supervivencia a la desecación de esta bacteria es mayor en fase estacionaria respecto de la fase exponencial, posiblemente debido a que las células cambian su composición de fosfolípidos de sus membranas capacitándolas para tolerar la pérdida de agua [61].

P. putida KT2440 entra en un estado viable no cultivable durante la desecación

Las células bacterianas que experimentan desecación muestran daño en sus membranas [47], se vuelven susceptibles a las especies reactivas de oxígeno (ROS) [89], metabólicamente no están activas y no reparan los daños [55]. Las proteínas y el ADN sufren cambios en su conformación y daño estructural [47, 90]; provocando estrés celular y en consecuencia ocurre la muerte celular en bacterias sensibles. Las bacterias tolerantes poseen mecanismos para contrarrestar todos estos daños, por ejemplo, pueden formar biofilms, acumular trehalosa, producir moléculas antioxidantes, formar esporas, entre otros [52, 91].

Las rizobacterias altamente tolerantes a la desecación no reducen sus capacidades de adhesión, colonización y promoción del crecimiento, tras la rehidratación [92]. Ejemplo de estas bacterias, incluyen a miembros de las cepas Azospirillum halopreferans, Gluconacetobacter dizotrophicus PAl 5, Paraburkholderia unamae MTl-641, entre otras [23, 36]. Por el contrario también existen PGPB sensibles a la desecación en donde tras la rehidratación, no son capaces de colonizar la rizósfera de las plantas y mucho menos promueven su crecimiento; tal es caso de Burholderia sacchari [23].

Una de las limitantes más fuertes para la efectividad de un inoculante es la capacidad de las bacterias para resistir a la desecación [23, 93]. Las bacterias sensibles pueden morir tras la inoculación de semillas, si después del sembrado no hay agua y ocurre una desecación [47]. De hecho, Bradyrhizobium japonicum muere en cuestión de horas tras la pérdida de agua [23, 46]. Interesantemente, P. putida KT2440 ha sido utilizada en el diseño de formulaciones destinadas para mejorar el crecimiento de plantas de maíz y biznaga, donde en conjunto con otras cepas bacterianas tolerantes a la desecación, potencian el desarrollo de las plantas, a pesar de que las células bacterianas fueron sometidas previamente a estrés por desecación [36, 59].

Cuando se sometió a P. putida KT2440 a una desecación al aire a 30 °C y 50% de Humedad Relativa (HR) en presencia de diferentes protectores (concentración de 200 mM), se observó que los disacáridos no reductores protegen a la bacteria de la desecación ambiental aun a los 18 DPID [62]. La trehalosa fue el mejor protector y permitió el aumento de la cultivabilidad de la cepa bacteriana de una BSR de 0 (sin protector) a una BSR de 90 (con protector). Cabe destacar que la concentración de este disacárido podría ser clave para conseguir esta protección, como ha sido observado bajo condiciones de liofilización [61]. La trehalosa a una concentración de 200 mM también protege a P. putida KT2440 de los tres tipos de estrés causados en liofilización [61]. Sin embargo, en liofilización se desconoce como ocurre la supervivencia de las células cuando estas se resguardan en condiciones de 1 atm de presión y en presencia de aire, en lugar de condiciones de vacío usadas durante la preservación de liófilos [57, 70]. Los disacáridos como la trehalosa, aparentemente son capaces de proteger a las membranas de la desecación mediante la sustitución de moléculas de agua [52]. Los disacáridos sustituyen los puentes de hidrógeno del agua, permitiendo que la membrana mantenga su fase de cristal fluida [69]. Sin embargo, los disacáridos también protegen a las proteínas y al ADN de forma directa [94, 95].

Las células de P.putida KT2440, aparentemente son sensibles a la desecación ambiental cuando se desecan en presencia de aire, durante 18 días, a 1 atm de presión, 30 °C y 50% HR y sin uso de protector [23]. Sin embargo, la bacteria regresa de forma rápida a un estado cultivable cuando interactúan con exudados de raíces de maíz, o tras una rehidratación prolongada (48 h) [62]. Lo que sugiere que la bacteria entra en un estado viable pero no cultivable. Una de las metodologías ampliamente usadas para demostrar el estado viable no cultivable es el “LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit” acoplado a la observación microscópica de fluorescencia [96], que se complementan con ensayos de RTqPCR para evaluar expresión de genes [96–98]. Usando el método “LIVE/DEAD” las células viables que poseen una membrana intacta se tiñen de verde y las células con membrana dañada se tiñen de rojo [99], por lo que se generaliza que las bacterias con membranas dañadas están muertas [100]. Cuando las células desecadas (durante 18 días) de P. putida KT2440 son rehidratadas, estas se tiñen de rojo [62]; lo que implicaría que ellas están muertas. Sin embargo, estas células retornan al estado cultivable tras una rehidratación prolongada o de forma rápida en presencia de exudados, y una vez que han regresado a este estado, las membranas incrementan la intensidad de color verde [62]; lo cual es visualizado de forma clara mediante un análisis de intensidad de fluorescencia (Figura 3). Por lo que se cuestiona si las bacterias mueren durante la desecación y resucitan tras la rehidratación o solo entran en un estado viable no cultivable por los daños ocasionados por la desecación y que esos daños sobre la membrana son subletales [62, 101]. Este cuestionamiento no ha podido ser respondido, no obstante, se ha aceptado que P. putida KT2440 es capaz de entrar en un estado viable no cultivable (VBNC) durante la desecación ambiental y que las bacterias reparan la membrana celular antes de poder ser nuevamente cultivables [62]. Independientemente de si es un estado VBNC o si ellas resucitan, esta bacteria tolera a la desecación; entrando en un estado de dormancia o tal vez de muerte [62, 101]. P. putida KT2440 activa sus actividades metabólicas, reparación de membrana y transcripción de genes clave tras la rehidratación prolongada [62], pero aún falta trabajo que aclare como es que la activación de transcripción y del metabolismo permiten que la bacteria retorne a un estado cultivable.

El C17:ciclopropano podría preparar a P. putida KT2440 para tolerar a la desecación

La membrana es la barrera principal de una bacteria para defenderse de cualquier tipo de estrés [102]. Las membranas bacterianas constituyen el primer punto de contacto entre los microorganismos y el medio ambiente, por lo que las bacterias han desarrollado diversos mecanismos para defenderse de la acción de diferentes agentes perturbadores, como cambios de temperatura o pH, y productos químicos nocivos [103]. Por esta razón, los estudios sobre lo que ocurre a la membrana durante la desecación de P. putida KT2440 y como ésta puede ser reparada es de gran interés, ya que podría aportarnos conocimiento de cómo se pueden inducir estos cambios en otras bacterias de interés biotecnológico, para la preparación de formulaciones en polvo estables.

La capacidad de alterar la composición de lípidos de la membrana, es fundamental para la supervivencia y adaptación bacteriana en respuesta al estrés ambiental [104]. En la desecación existe un daño a la membrana plasmática, en donde los lípidos pasan a una fase de gel, que desencadena una mayor rigidez de la membrana [47, 61, 69]. En P. putida KT2440 se ha demostrado que cuando las células tienen un nivel de C17:ciclopropano elevado, éstas son más tolerantes a la desecación por liofilización y las mutantes defectivas en el gen cfaB ya no son tolerantes a la desecación por liofilización [61]. El gen cfaB codifica para una ciclopropano sintasa que es capaz de transformar el C16:cys en C17:ciclopropano, usando S-adenosil metionina como donador de grupos metilo (Figura 4). Por esta razón las mutantes defectivas en este gen casi no producen C17:ciclopropano. Será interesante en un futuro evaluar si bajo condiciones de desecación ambiental, el C17:ciclopropano incrementa en P. putida KT2440; aportando una adaptación a las condiciones de baja disponibilidad de agua.

Transcriptómica de P. putida KT2440 bajo condiciones de limitación de agua

Los estudios globales de expresión de genes son muy importantes para poder comprender cuales de ellos podrían estar implicados en una función de interés [105]. Por ejemplo, si estamos buscando genes de una bacteria que se expresan en condiciones de salinidad, esta bacteria se crecerá en dos condiciones: sin estrés salino y en alta salinidad. Se extraerá ARN de las bacterias que crecieron en ambas condiciones y se estudiará la diferencia que existe en la cantidad de transcritos en una condición respecto de la otra. Es importante señalar que en estos estudios se designa un número de corte para validar si existe una diferencia en la expresión; ese número en términos generales corresponde a la cantidad de veces más o veces menos que un transcrito es expresado. Existen algunos problemas relacionados con estos estudios [106], siendo el límite de corte de la expresión uno de los principales; ya que se pueden descartar genes que se expresan por debajo del corte asignado, pero cuya expresión es suficiente para desencadenar una función [105]. No obstante, estos estudios son un acercamiento bastante acertado para conocer a los genes implicados en un proceso biológico. La expresión de los genes de mayor interés, obtenido en estudios de expresión global, se tiene que confirmar mediante estudios más finos de expresión; como el método de RTqPCR [107, 108] o RTPCR [109]. Lo más interesante de estos estudios es armar el rompecabezas para entender como unir la expresión de los genes con el modelo biológico en estudio.

Hay diversas maneras en los que se pueden realizar los estudios globales de expresión de genes [110]. Sin embargo, dos metodologías se usan ampliamente: 1) estudios de expresión de genes mediante microarreglos [111, 112], 2) estudios de expresión de genes a través de la metodología RNA seq [113, 114]; siendo la segunda metodología más ampliamente usada en nuestros días [110], debido a la evolución de la secuenciación masiva, porque los resultados son de mayor sensibilidad, es altamente reproducible, no se requiere conocimiento previo de los genes a estudiar, los costos son cada vez menores [105, 110]. Otra forma de estudiar genes implicados en un proceso biológico de forma global, es mediante mutagénesis con minitransposones portando genes reporteros y estudiando la expresión de esos genes reporteros [88].

En P. putida se han realizado algunos estudios de expresión de genes bajo condiciones de limitación de agua y bajo condiciones de desecación [88, 101, 115, 116]. Por ejemplo, en P. putida LH0001, se identificaron los genes que están controlados por estrés hídrico y para generar mutantes defectuosos en la tolerancia a la desecación, se realizó la construcción de una librería por mutagénesis al azar con el uso del mini-Tn5-pho A [88]. Se identificaron 20 genes que fueron inducidos por un estrés hídrico, pero no por un estrés osmótico provocado por polietilen glicol (PEG); termodinámicamente equivalente. Once genes fueron inducidos por ambos tipos de estrés, tres genes fueron inducidos por un estrés osmótico y tres genes fueron reprimidos por un estrés hídrico. Veintiséis genes fueron homólogos a las secuencias presentes en la secuencia completa del genoma de P. putida KT2440 o la secuencia del plásmido pWWO que participan en el destino de las proteínas, la adquisición de nutrientes o solutos, la generación de energía, la motilidad, la biosíntesis de alginato o la estructura de la envoltura celular, y la función de cinco no se pudieron predecir a partir de la secuencia. Estos datos proporcionan una visión global del entorno que perciben las bacterias en los hábitats de bajo contenido de agua y sugieren que los mecanismos de adaptación para el crecimiento en hábitats de bajo contenido de agua son diferentes de los del crecimiento en hábitats de alta osmolaridad.

El alginato, es un exopolisacárido (EPS) producido por P. putida [117], este EPS crea ambientes hidratados y alivia el efecto de la limitación del agua [118]. En un estudio transcriptómico de P. putida KT2440 bajo condiciones de limitación de agua se observó una expresión transitoria de genes de síntesis de alginato de KT2440. Los genes de síntesis de alginato fueron sobreexpresados tras las 4 h de estrés, pero disminuían sus niveles de expresión con un estrés prolongado [116]. Estos hallazgos apoyan el papel del alginato como un EPS importante bajo limitación de agua para esta bacteria. P. putida también es capaz de producir otros EPS como la celulosa, exopolisacárido a y exopolisacárido b [81, 119]. La función de los EPS bajo una leve limitación de agua fue estudiada; usando un modelo de superficie porosa presurizada [120]; creando condiciones limitadas de agua parecidas a lo que ocurre en el suelo. Las morfologías de las colonias y los transcriptomas del genoma completo de P. putida KT2440 de tipo silvestre y sus mutantes deficientes en la síntesis de alginato o de otros EPS conocidos fueron considerados. En general, los resultados mostraron que el alginato es un exopolisacárido importante bajo limitación de agua y en ausencia de alginato se activan otros mecanismos de tolerancia; como los genes relacionados con el estrés oxidativo, genes relacionados con la integridad de la membrana, genes que codifican para proteínas de choque térmico y proteínas de estrés universales, entre otros [115].

En un estudio reciente de microarreglos cuando P putida KT2440 entra en estado VBNC tras la desecación, se observó que se activan los receptores dependientes de TonB asociados a el transporte de sideróforos de hierro y después de la rehidratación se activan procesos catabólicos de fenilalanina/tirosina para la síntesis de ubiquinona [101].

La rehidratación activó en un principio a 6 genes que fueron sobreexpresados (estado VBNC). Sin embargo, la respuesta principal se detectó después de 24 h de rehidratación con 148 genes regulados positivamente y 42 regulados negativamente (estado cultivable) [101]. Durante el estado VBNC, P. putida activó procesos de transporte transmembrana como el de los sideróforos a través de un transportador dependiente de TonB y sistemas de transporte de alcohol polihídrico putativo. La rehidratación prolongada con agua destilada resucitó las células de P. putida KT2440 activando el catabolismo de fenilalanina / tirosina para proporcionar energía y carbono para la biosíntesis de ubiquinona, mientras se mantiene una síntesis de proteínas reducida. Por otro lado, la interrupción del gen del receptor dependiente de TonB (PP_1446) provocó un incremento en la supervivencia a la desecación de la cepa mutante. La activación del sistema de transporte de hierro (receptor de sideróforo dependiente de TonB) y el transporte de alcohol podrían ayudar a mantener un estado VBNC de P. putida KT2440. Posiblemente la activación del catabolismo de fenilalanina / tirosina y la síntesis de proteínas reducida, son requeridas por la bacteria para su reanimación del estado de VBNC [101].

Los estudios transcriptómicos en condiciones de desecación han sido desarrollados en condiciones diferentes y podríamos suponer que son fotos que describen la expresión global de los genes participantes en el instante de tiempo estudiado. Es por ello, que aún se requiere un mayor esfuerzo para comprender que genes se deben expresar para permitir a P. putida KT2440 tolerar a la desecación y cuáles son los determinantes principales para obtener formulaciones en polvo más estables.

CONCLUSIONES

El uso de fertilizantes nitrogenados y otros productos de la revolución verde ha traído graves consecuencias al ambiente, es urgente cambiar las prácticas agrícolas para evitar este tipo de insumos. Las bacterias promotoras del crecimiento de plantas podrían ser una excelente alternativa para mantener los rendimientos elevados disminuyendo el uso de fertilizantes. Se han estudiado varias bacterias con potencial promotor de crecimiento, una de ellas es P. putida KT2440; una bacteria benéfica que tiene la capacidad de biorremediar el suelo y promover el crecimiento de plantas con las que se asocia, especialmente bajo condiciones de estrés.

Las formulaciones microbianas en polvo serían ideales porque su transporte es económico y no se requiere de refrigeración para conservar el producto. La desecación puede conseguirse de varias formas, dos de las cuales son la liofilización y la desecación ambiental; ambas difieren por el tipo de estrés al que las células se enfrentan. Se han encontrado bacterias benéficas altamente tolerantes a la desecación, las cuales son candidatas para ser aplicadas en zonas de escasez de agua y para la formulación de inoculantes en polvo más estables. Sin embargo, muchas bacterias benéficas son sensibles a la desecación. P. putida KT2440 tiene una menor capacidad de tolerancia en comparación con las bacterias benéficas resistentes, sin embargo, tiene la característica de entrar a un estado VBNC y retornar al estado cultivable, tras la rehidratación prolongada o bien retornar de forma rápida con una rehidratación en presencia de exudados. Entender la forma en que podemos proteger a la bacteria de la desecación nos ayudará a incrementar la supervivencia de la bacteria cuando se enfrenta a condiciones limitantes de agua. La trehalosa es un disacárido no reductor que protege a la membrana de P. putida KT2440, tanto a la desecación por liofilización como a la desecación ambiental. Aún se desconoce el tiempo límite que esta protección puede otorgar si la bacteria se resguarda en presencia de aire, independientemente del método usado para la desecación. En acuerdo con los datos generados a la fecha, un cambio en la composición de los fofolípidos de la membrana, especialmente en el aumento del C17:ciclopropano, puede capacitar a las bacterias para tolerar más a la liofilización, pero se desconoce si puede incrementar en condiciones de desecación ambiental. Los estudios de transcriptómica nos revelan varios genes que pudieran estar implicados en la respuesta de P. putida KT2440 tanto para soportar a la desecación, como para retornar a su cultivabilidad. Estudios futuros permitirán entender mejor como podríamos incrementar la supervivencia de la bacteria rumbo a la generación de inoculantes en polvo más estables para aprovechar sus potencialidades tras la rehidratación.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la VIEP y al Comité de Internacionalización de la Investigación, ambos de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, por el apoyo otorgado para el desarrollo de proyectos del grupo “Ecology and Survival of Microorganisms”.

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